Jesús Muñoz-Rojas y Jesús Caballero-Mellado

Programa de Ecología Molecular y Microbiana, Centro de Investigación sobre Fijación de Nitrógeno, Universidad Nacional Autónoma de México. Apdo. Postal No. 565-A, Cuernavaca Morelos.

Introducción

Los microorganismos endófitos comprenden a los hongos y bacterias que viven sin causar daño en el interior de células o tejidos de plantas superiores durante una parte considerable de su ciclo de vida (72). En general, los microorganismos endófitos pueden localizarse en espacios intracelulares, intercelulares o en el tejido vascular (72, 73).

La asociación de los microorganismos endófitos con su hospedero puede ser mutualista y llegar hasta el umbral de un organismo patógeno en estado de latencia (88). Existen alrededor de 500,000 variedades distintas de plantas superiores, por lo que la diversidad de hongos y bacterias asociadas pueden estimarse en valores superiores, sugiriendo una extensa diversidad de endófitos (88) y la posibilidad de usarlos en agrobiotecnología. Especies de los géneros Pseudomonas, Enterobacter, Bacillus, Erwinia y Xanthomonas han sido aislados frecuentemente de diversas plantas.

La diversidad y número de bacterias rizoféricas es muy grande, lo cual ocasiona que en este ambiente exista una fuerte competencia por los nutrientes y en consecuencia que su disponibilidad sea limitada. Sobre esta base se ha considerado que las bacterias endófitas podrían tener algunas ventajas competitivas sobre las bacterias rizosféricas, ya que la disponibilidad de nutrientes es mayor en el interior de las plantas y el número de microorganismos endófitos es menor que el de los rizosféricos (45). Por otro lado, las bacterias endófitas se encuentran mejor protegidas que las rizosféricas de las condiciones adversas que se presentan en el medio ambiente (73). Considerando que las bacterias endófitas se ubican en contacto íntimo con las plantas, ellas podrían brindar beneficios más directos a su hospedero en comparación con las bacterias rizosféricas. Por ejemplo, podrían excretar fitohormonas en el interior de las plantas y/o protegerlas contra la acción de los fitopatógenos. Se ha demostrado que algunas fitohormonas, e.g., ácido indol acético, producidas por los microorganismos rizosféricos pueden provocar un aumento de la superficie de la raíz, permitiendo a la planta una mayor absorción de nutrientes (66). La protección podría ser a través de efectos antagónicos, debido a la producción de substancias que inhiben el crecimiento de los patógenos (64) o bien, por el desencadenamiento de una respuesta de defensa de la planta en contra de patógenos inducida por el endófito, en forma similar a la que se observa con algunas rizobacterias (71). Por otro lado, se ha sugerido que el interior de las plantas es un ambiente propicio para que se lleve a cabo la fijación biológica de nitrógeno (FBN), ya que este ambiente es bajo en oxígeno y relativamente alto en fuentes de carbono (45, 46, 85), por lo que las bacterias diazótrofas endófitas podrían fijar el nitrógeno y liberarlo directamente en el interior de las plantas (25) contribuyendo con una parte de los requerimientos nitrogenados de la planta hospedera (12).

Con excepción de las plantas leguminosas y los árboles actinorrízicos, ninguna otra familia de plantas en asociación con bacterias tiene la capacidad de formar estructuras nodulares donde se lleve a cabo la FBN. No obstante, con el empleo de diversas metodologías, como el balance de nitrógeno, la dilución de N¹⁵, y la abundancia natural de N¹⁵, se ha demostrado que existen altos índices de FBN en plantas gramíneas de importancia económica entre las que se incluyen algunas variedades de caña de azúcar (11, 13, 56, 96, 99), de arroz (81) y el pasto forrajero Kallar (Laptochloa fusca) (60). Estos hallazgos han generado un gran interés en la fijación biológica de nitrógeno en plantas de familias diferentes a las leguminosas. Aún cuando no se conoce cual o cuales son los microorganismos responsables de la FBN observada en las plantas gramíneas, son diversos los diazótrofos endófitos que se han aislado de estas plantas, entre los que se encuentran especies de los géneros Gluconacetobacter, Azoarcus, Azospirillum, Enterobacter, Herbaspirillum, Klebsiella y Burkholderia. Será de gran importancia conocer la función(es) que desempeñan los endófitos, incluyendo los fijadores de nitrógeno, en el interior de las plantas y determinar si estimulan su crecimiento.

Historia

La bacteria motivo de este capítulo fue aislada por vez primera por Cavalcante y Döbereiner en 1988 (21) a partir de raíces y tallos de diferentes variedades de caña de azúcar (Saccharum officinarum) cultivadas en diversas regiones de Brasil. La bacteria recién descubierta fue descrita como "una nueva bacteria fijadora de nitrógeno tolerante al ácido" la cual recibió el nombre de Saccharobacter nitrocaptans (21). No obstante, durante el período de impresión del trabajo referido se incluyó como addendum el cambio de nombre ya propuesto, y a la nueva bacteria se le daba el nombre de Acetobacter nitrocaptans, sobre la base de experimentos de hibridación RNA/DNA y DNA/DNA. Anecdóticamente, el sobretiro recibido por JCM venía con una corrección, hecha de puño y letra de Johanna Döbereiner, en la que se indicaba el nombre de la especie como Acetobacter diazotrophicus. Fueron solo algunos meses después cuando Acetobacter nitrocaptans recibía el nombre oficial de Acetobacter diazotrophicus (39), nombre con el cual aun hoy día se sigue reconociendo a esta especie. Sin embargo, Yamada y col., (97) propusieron un nuevo esquema en la taxonomía de la familia Acetobacteraceae, y actualmente el primer fijador de nitrógeno descrito en esta familia es referido oficialmente como Gluconacetobacter diazotrophicus.

El descubrimiento de G. diazotrophicus serviría como modelo pionero de bacteria endófita fijadora de nitrógeno, pero además abriría un nuevo capítulo en la investigación sobre fijación de nitrógeno en plantas no leguminosas. Los estudios sobre endófitos fijadores de nitrógeno han tomado gran auge en la actualidad, basados en las ideas pioneras sobre el potencial agrobiotecnológico de G. diazotrophicus. Las características consideradas fueron el habitat endófito y la capacidad de fijar N₂ en la presencia de nitratos (21), así como el excelente crecimiento de G. diazotrophicus en condiciones in vitro similares a las encontradas en la caña de azúcar (13). Esto significaba que al multiplicarse G. diazotrophicus en el interior de la caña de azúcar existiría, por un lado, menor competencia por los nutrientes en comparación con el ambiente rizosférico y por otro, podría disponer de abundantes fuentes de carbono, producto de la fotosíntesis, para llevar a cabo la fijación de nitrógeno aun cuando los cultivos fueran fertilizados con este elemento. El nitrógeno, producto de la fijación biológica, sería excretado directamente en el interior de los tejidos de la planta, la cual los usaría para cubrir al menos parcialmente sus requerimientos en la síntesis de macromoléculas esenciales. El potencial agrobiotecnológico se amplió cuando se demostró que G. diazotrophicus tenía efectivamente la capacidad de excretar el 50% del nitrógeno fijado (22), así como de producir diversas auxinas, especialmente ácido indol acético (7, 35) y citocininas (48) las cuales podrían ejercer efectos directos sobre la fisiología de la planta e influir sobre el crecimiento de la caña de azúcar.

Técnicas de aislamiento y medios de cultivo

El aislamiento exitoso de una especie endófita particular depende de los métodos y medios de cultivo empleados. Es conocido que dependiendo de las características del medio (e.g., pH, fuente de carbono y nitrógeno) es el tipo de bacteria que se logra aislar (5). Para el aislamiento de G. diazotrophicus y en general de los endófitos, las plantas son lavadas con agua de la llave, y posteriormente desinfectadas con alcohol al 70%. Enseguida las plantas son enjuagadas con agua destilada y esterilizadas superficialmente, por ejemplo, con Cloramina T al 1% (35) o hipoclorito de sodio al 4% (59). Después, las plantas se enjugan abundantemente en condiciones de esterilidad para eliminar la sustancia empleada en la esterilización. Posteriormente, las muestras son maceradas en un volumen suficiente para obtener una dilución 1:10 (peso-volumen) y son inoculadas en medios de cultivo adecuados para el aislamiento de la bacteria de interés. Una estrategia alternativa para el aislamiento de G. diazotrophicus fue utilizada por Dong y col. (27), pero puede ser empleada para el aislamiento de otros endófitos. Esta estrategia consiste en impregnar con alcohol la superficie de los esquejes de tallo de caña de azúcar y esterilizar por fuego directo. Posteriormente los esquejes son centrifugados con una velocidad de 30 a 3000 g en tubos estériles para obtener el fluido apoplástico el cual contiene a las bacterias endófitas. El fluido puede sembrarse directamente o diluirse y alícuotas son sembradas en los medios de cultivo apropiados para el enriquecimiento de los diazótrofos de interés. Con estas técnicas, la contaminación por hongos puede ocurrir especialmente en medios de cultivo con pH ácido, lo cual se evita con la adición de antifúngicos, e.g., cicloheximida (3, 35). Cuando se requiere conocer el número de bacterias asociadas con la planta en estudio generalmente se recurre al método del número mas probable (MPN), para lo cual se preparan diluciones decimales a partir del macerado original o del fluido apoplástico y alícuotas de cada dilución son inoculadas por triplicado o quintuplicado en los medios de cultivo apropiados.

G. diazotrophicus puede ser aislado fácilmente utilizando medios de cultivo semigelificados y libres de nitrógeno combinado. Por ejemplo, en el medio LGI semigelificado, adicionado con azul de bromotimol, pH 5.5 (21), la bacteria forma una película densa de color amarillo 1 mm abajo de la superficie del medio, tornándose el color amarillo del medio de cultivo a incoloro después de 7 días de incubación a 30oC (Fig. 1). Para el aislamiento de G. diazotrophicus en cultivo puro se puede ocupar el medio LGI en placa adicionado con extracto de levadura (50 mg/l). Las colonias de esta especie son planas, de forma irregular y toman un color naranja intenso después de 5 días de incubación (Fig. 2). Sin embargo, estas características no son absolutas para la identificación de la especie G. diazotrophicus. Las bacterias fijadoras de nitrógeno designadas previamente como tipo DOR y tipo SAd, (49), reconocidas actualmente como dos nuevas especies del género Gluconacetobacter, G. johannae y G. azotocaptans (33), pueden ser confundidas con G. diazotrophicus cuando crecen en placa sobre el medio LGI (Fig. 3). Aunque el medio LGI es el de elección para la purificación de G. diazotrophicus, para algunos fines específicos frecuentemente se recurre a otros medios de cultivo, como por ejemplo el medio SYP (19) o el medio MESMA (34).

Caracterización fenotípica y genotípica de G. diazotrophicus

La familia Acetobacteraceae pertenece a la subclase a-Proteobacteria (100). Son bacterias aeróbicas, gram negativas o gram variables que se caracterizan fenotípicamente por su capacidad de oxidar etanol a ácido acético en medios de cultivo con pH neutro o ácido (24, 89). Genotípicamente la familia Acetobacteraceae puede ser distinguida de otras a-Proteobacteria por la presencia de dos sitios de restricción SphI y NcoI internos en la secuencia del gen 16S ADN-ribosomal, excepto en Gluconobacter oxydans en el que falta uno de los sitios NcoI, correspondiente al nucleótido 110 de G. diazotrophicus (18, 49). Por lo tanto, cuando el ADN de un miembro de esta familia es digerido con la enzima de restricción SphI y se hibrida con una sonda de los genes 16S ADN-ribosomal, se detecta una banda de hibridación de 1.3 kb y cuando la restricción se hace con la enzima NcoI se encuentra una banda de 1.24 kb.

Tradicionalmente la familia Acetobacteraceae se ha dividido en los géneros Acetobacter y Gluconobacter (24, 89). Sin embargo, la clasificación de las bacterias acéticas ha sido materia de controversia durante largo tiempo (15, 82, 89, 94). Recientemente, Yamada y col. (97) propusieron la división de la familia Acetobacteraceae en los géneros Acetobacter, Gluconobacter, Gluconoacetobacter y Acidomonas, sobre base del análisis de secuencias parciales del gen 16S ARN-ribosomal y del tipo de ubiquinona predominante. De esta forma, en el género Acetobacter fueron incluidas las especies que tienen el tipo de ubiquinona Q9, entre las que se encuentran Acetobacter aceti y Acetobacter pasteurianus, en tanto que las otras especies de Acetobacter equipadas con ubiquinona Q10, incluida A. diazotrophicus, fueron transferidas al género Gluconoacetobacter, con la especie tipo Gluconoacetobacter liquefaciens. En este género también fueron incluidas las especies G. xylinus, G. hansenii, y G. europaeus. El nombre de Gluconoacetobacter fue corregido a Gluconacetobacter (98), con base en la regla 61 del código internacional de nomenclatura bacteriana. Posteriormente otras especies de bacterias acéticas han sido descritas, entre ellas Acetobacter obodiens y A. pomorun (84), las cuales deben ser reasignadas al género Gluconacetobacter, y G. sacchari (32). Recientemente han sido descritas dos nuevas especies de Gluconacetobacter, G. johannae (en honor de Johanna Döbereiner) y G. azotocaptans (33).

Los géneros Acetobacter, Gluconacetobacter y Acidomonas son capaces de oxidar completamente el etanol y el lactato a CO₂ y H₂O (89). Aún cuando el género Gluconacetobacter comparte con otros miembros de la familia Acetobacteraceae la capacidad de oxidar el etanol, este es el único género de la familia, reconocido actualmente, que contiene especies con la capacidad de fijar nitrógeno atmosférico (39, 89, 33).

El crecimiento óptimo de G. diazotrophicus se presenta a 30oC en medios de cultivo que contienen 10% de sacarosa y pH de 5.5. Sin embargo, esta bacteria es capaz de crecer en concentraciones de sacarosa hasta del 30% (21). La especie G. diazotrophicus, puede usar glucosa, fructosa o sacarosa como única fuente de carbono, produciendo ácido a partir de estos substratos (21, 33). Con excepción de la sacarosa, esta especie no usa otros disacáridos y no es capaz de crecer con ácidos dicarboxílicos como única fuente de carbono (87, 95). G. diazotrophicus lleva a cabo la FBN en condiciones microaerofílicas a pH ácido, incluso abajo de 3.0, así como en presencia de altas concentraciones de nitratos (10mM) y su actividad nitrogenasa es inhibida solo parcialmente aún a concentraciones de 20 mM de (NH₄)₂SO₄ o por aminoácidos (87). Estas características de G. diazotrophicus, son compartidas por las especies G. johannae y G. azotocaptans. La especie G. diazotrophicus puede ser diferenciada de las otras especies fijadoras de nitrógeno del género por la formación de colonias de color café obscuro (chocolate) con bordes claros en un medio de cultivo a base de extracto de papa adicionado con 5, 10 ó 15% de sacarosa, después de 5 a 7 días de incubación (33). Las especies G. johannae y G. azotocaptans permanecen de color beige o crema aun después de 10 días de incubación (Fig. 4). En la Tabla 1 se describen algunas características que permiten diferenciar a las especies fijadoras de N₂ del género Gluconacetobacter.

La electroforesis de proteínas totales en geles de poliacrilamida-duodecil sulfato (SDS-PAGE) también se ha usado exitosamente en la caracterización de la especie G. diazotrophicus (90, 39). La electroforesis de enzimas metabólicas (MLEE) ha sido otra de las estrategias usadas en la caracterización y diferenciación de cepas de G. diazotrophicus (17, 19), así como en la diferenciación de esta especie de otras especies de acetobacterias (49, 33). Con esta metodología se han logrado identificar 14 patrones diferentes de enzimas metabólicas o tipos electroforéticos (ET1 a ET14) en cepas designadas como típicas de la especie G. diazotrophicus (Fig. 5), con la excepción del ET 13, el cual representa una cepa que difiere en algunas características con esta especie (49). Es de interés destacar que cerca del 98% de las cepas de G. diazotrophicus aisladas de plantas de caña de azúcar cultivadas en diferentes regiones de México han sido agrupadas en el ET 1 (17, 19), en tanto que numerosas cepas aisladas de plantas cultivadas en Brasil son agrupadas en 7 ETs, aunque predominan las cepas representadas por el ET 3 (17). Además, el ET 1 se ha identificado entre cepas de G. diazotrophicus aisladas de todos los hospederos conocidos colectados en México, Brasil y otros países como Cuba y la India (17, 49, 90, resultados no publicados).

Previo a la descripción de las especies G. johannae y G. azotocaptans se reportó que la caracterización específica de G. diazotrophicus se lograba mediante la amplificación del gen 16S ADN-ribosomal usando los oligonucleótidos AC (5'-CTGTTTCCCGCAAGGGAC-3') y D1 (5'-GCGCCCCATT GCTGGGTT-3'), los cuales generan una banda de 445 pb (83). No obstante, con estos oligonucleótidos también se amplifica una banda de 445 pb en las especies G. johannae y G. azotocaptans (Fuentes-Ramírez, com. personal) por lo que la amplificación puede considerarse específica para las especies fijadoras de N₂ del género Gluconacetobacter conocidas. La caracterización específica de G. diazotrophicus pudiera lograrse mediante la amplificación del gen 23S ADN-ribosomal, usando el oligonucleótido 1440 (5'-GTTGGCTTA GAAGCAGCC-3', hélice 43a/43b) y el oligonucleótido AD (5'-TGCGGCAAAAGCCGGAT-3'), que generan un producto de 411pb(51).La secuencia complementaria AD ha sido usada como sonda de hibridación para la identificación de G. diazotrophicus, así como para su diferenciación de otras especies no fijadoras de N₂ del género (51). No obstante, es necesario determinar si con estos oligonucleótidos se pueden diferenciar las otras especies fijadoras de N₂ del género Gluconacetobacter.

Los patrones de hibridación de los genes estructurales de la nitrogenasa (nifHDK) y de los genes 16S ADN-ribosomal de G. diazotrophicus, así como ensayos de homología ADN-ADN han sido estrategias clave en la identificación de G. diazotrophicus y en su diferenciación con otras especies (49, 33). En las cepas típicas de G. diazotrophicus, se han observado tres bandas comunes de hibridación con los genes nifHDK (1.25, 2.0 y 9.0 kb) (Fig. 6) y 4 bandas de hibridación con los genes 16S ADN-ribosomal (1.6, 2.3, 3.6 y 9.3 kb) (Fig. 7) (19, 49), con excepción del ET 13 en el cual las 4 bandas de hibridación con los genes nifHDK difieren en tamaño (1.0, 1.20, 3.5 y 7.6 kb). Para la identificación de G. diazotrophicus, también se han realizado ensayos de hibridación con una sonda específica al gen 16S ARN-ribosomal de esta especie (90). La homología ADN/ADN que se observa entre las cepas de G. diazotrophicus analizadas en diferentes estudios se encuentra en el rango de 70 a 100% (19, 39, 49). La homología ADN/ADN del 70% es considerada el límite inferior para la diferenciación de especies (86).

Hospederos y dispersión de G. diazotrophicus

Como fue mencionado anteriormente, G. diazotrophicus fue aislado por vez primera de raíces lavadas y del interior del tallo de la caña de azúcar (21). Posteriormente, la asociación de G. diazotrophicus con la caña de azúcar fue confirmada al lograrse su aislamiento de los tejidos internos de diferentes variedades de caña de azúcar cultivadas en Australia (55) y México (35), pero no de la rizosfera de las plantas analizadas. Además G. diazotrophicus fue aislado del insecto homóptero Saccharococcus sacchari (3) plaga común en todas las regiones donde se cultiva la caña de azúcar, así como de plantas de camote (Ipomoea batatas) y de Pennisetum purpureum var. Camerún (26). La ausencia de G. diazotrophicus tanto de la rizosfera de la caña (21) como de la rizosfera de otras plantas (55), así como su ausencia en el interior de plantas diferentes a la caña que fueron colectadas entre los surcos de este cultivo (76), apoyaron la idea sobre el carácter endófito de esta bacteria y su asociación específica con plantas que acumulan sacarosa y que se propagan en forma vegetativa (26). Estos conceptos son aceptados generalmente en la actualidad y son apoyados con el aislamiento reciente de G. diazotrophicus de los tejidos internos de plantas adultas e hijuelos de la piña (Ananas comosus), aunque no de su rizosfera (90). No obstante, G. diazotrophicus ha sido detectado ocasionalmente en la rizósfera de la caña de azúcar (55) y también ha sido aislada tanto de la rizosfera como de los tejidos internos de otras plantas tales como el cafeto (Coffea arabica) (49) y del cereal Eleusine coracana (59) las cuales aparentemente no son ricas en sacarosa. El hecho de que G. diazotrophicus haya sido aislado de plantas pertenecientes a familias tan diversas como las Poaceae, Convolvulaceae, Rubiaceae y Bromeliaceae sugiere que esta bacteria tiene una amplia capacidad para dispersarse y colonizar diferentes hospederos. Se ha propuesto que los sitios de origen de las plantas leguminosas coinciden con los centros de diversificación de sus bacterias simbióticas (61). Esta situación no es clara en la interacción G. diazotrophicus-planta hospedera, ya que la caña de azúcar es originaria de Nueva Guinea (57), el cafeto del Medio Oriente (67) y la piña de la región Amazónica (58). No obstante y tomando en cuenta que la diversidad genética de la población de G. diazotrophicus aislada de la planta del cafeto es mayor que la diversidad encontrada en las poblaciones recobradas de otros hospederos, se ha sugerido que la asociación de G. diazotrophicus con la planta del cafeto es más antigua que la asociación con otras plantas hospederas (90). Existe la posibilidad de que el hospedero primario de G. diazotrophicus no sea una planta de interés agrícola y por lo tanto aun no se haya detectado. En cualquier forma, de acuerdo con los resultados obtenidos hasta ahora, es de esperarse que en el futuro cercano se descubran otras plantas con las cuales se asocia G. diazotrophicus.

Considerando el carácter endófito de G. diazotrophicus en plantas que se propagan asexualmente, se ha propuesto que su dispersión geográfica a gran distancia se lleva a cabo durante la reproducción del material vegetativo que alberga a la bacteria en forma natural. Por ejemplo, el aislamiento de G. diazotrophicus se logró a partir de esquejes de caña de azúcar cultivados en Cuba, los cuales fueron transportados a Canadá y propagados bajo condiciones de invernadero (27, 28). Esta forma de dispersión parece exitosa tomando en cuenta el intenso intercambio de variedades de caña de azúcar que existe entre los países productores (17). Es concebible que la dispersión regional de G. diazotrophicus entre variedades de caña de azúcar, cultivada comercialmente o en campos de germoplasma, se logre a través de insectos como S. sacchari, conocido en México como chinche harinosa. Es de interés comentar que la frecuencia de aislamiento de G. diazotrophicus es mayor en los tejidos cercanos a la región apical de los tallos de caña de azúcar (35) los cuales corresponden a las áreas (entrenudos 8-10) donde se alimenta la chinche harinosa (Fig. 8). De otros insectos tales como áfidos, hormigas y chapulines, colectados sobre plantas de caña de azúcar, no se logró el aislamiento de G. diazotrophicus (3). Probablemente la característica ácida de las secreciones de la chinche harinosa, en los cuales la fructosa es el azúcar más abundante, juegue una función importante en la multiplicación de G. diazotrophicus, ya que las secreciones de los chapulines aunque ricas en sacarosa son alcalinas (3). También se ha sugerido que la transmisión y dispersión de G. diazotrophicus pudiera ser a través de esporas de algunos hongos micorrízicos del tipo vesículo-arbuscular (VAM) (25, 26) de los géneros Glomus y Acaulospora (69). De hecho se ha demostrado experimentalmente que la introducción de G. diazotrophicus a la caña de azúcar puede ser facilitado con la co-inoculación de esporas VAM (68, 69). Resultados similares fueron reportados cuando plántulas de Sorghum bicolor fueron inoculadas tanto con G. diazotrophicus como con cepas de Glomus (44). Además, las esporas podrían proporcionar a G. diazotrophicus protección contra las condiciones adversas del medio ambiente, e.g., cuando la bacteria se encuentra en la rizósfera del cafeto.

Características genómicas de G. diazotrophicus

Muy poco se conoce sobre las características del genoma de G. diazotrophicus en comparación con otras bacterias que se asocian con plantas de interés agrícola, tales como Rhizobium o Azospirillum. Recientemente se iniciaron los estudios para conocer la secuencia completa del genoma de G. diazotrophicus (40) y actualmente se conoce que el genoma de esta especie bacteriana tiene un tamaño aproximado de 4.2 Mb. El análisis de la secuencia del genoma aportará información sobre los genes involucrados en la interacción de la bacteria con sus hospederos, y particularmente sobre las características que podrían ser usadas en procesos de biotecnología agrícola.

Los plásmidos constituyen una parte sustancial del genoma de muchas de las especies bacterianas, desempeñando algunos plásmidos funciones importantes en la interacción hospedero-bacteria (9, 23, 37, 65). Sobre la base de estos conocimientos fueron analizadas diferentes cepas de G. diazotrophicus, encontrándose que la presencia de plásmidos de 20 a 170 kb es común en esta especie (Fig. 9), aún cuando la cepa tipo (PAl 5T = ATCC 49037) carece de ellos (16, 19, 91). Estos plásmidos podrían conferir algunas ventajas competitivas a las cepas de G. diazotrophicus que los contienen. Se ha sugerido que el plásmido de 170 Kb, albergado por muchas cepas aisladas de diferentes hospederos cultivados en México y Brasil, pudieran desempeñar una función importante en la asociación con la planta (17). Sin embargo, actualmente se desconocen los genes presentes en los plásmidos encontrados en cepas de G. diazotrophicus así como la función que desempeñan, por lo cual se les puede definir como plásmidos crípticos. La existencia de cepas de G. diazotrophicus carentes de plásmidos permitió sugerir que las características fenotípicas fundamentales de esta especie, como son la producción de ácido acético, oxidación de etanol, lactato y otras fuentes de carbono, la fijación de nitrógeno y la producción de ácido indolacético no son codificadas en plásmidos (19). De hecho fue demostrado que los genes estructurales de la nitrogenasa (nifHDK) se encuentran localizados en el cromosoma (19).

El análisis de poblaciones de G. diazotrophicus, aisladas de la caña de azúcar y de algunos otros hospederos, reveló que su diversidad genética es muy limitada, alrededor de 0.060 (17, 19). Este nivel de diversidad observado en G. diazotrophicus es uno de los más bajos entre todas las especies bacterianas analizadas (61). También se conoce que la estructura genética de G. diazotrophicus es de tipo clonal (17). Estos análisis en conjunto sugieren poca variabilidad del genoma de G. diazotrophicus.

Genes de G. diazotrophicus involucrados en la fijación biológica de nitrógeno

La síntesis de la enzima nitrogenasa activa requiere de la transcripción y traducción de alrededor de 20 genes, los cuales han sido identificados y caracterizados en diversas especies de diazótrofos (77). La FBN es un proceso que demanda mucha energía, por lo que los organismos fijadores de nitrógeno tienen que regular finamente la síntesis y la actividad de la nitrogenasa en respuesta a factores del medio ambiente tales como el oxígeno y el nitrógeno combinado (62). Para entender el proceso de fijación de nitrógeno en G. diazotrophicus se ha iniciado la identificación y la caracterización de los genes reguladores relacionados a los genes nif (78). El aislamiento y la secuenciación de los genes nif se logró construyendo una librería genómica de G. diazotrophicus en E. coli, usando el cósmido pLAFR3 de amplio rango de hospedero (78, 92) ó el vector de clonación lamda EMBL3 (78). Las clonas de esta librería fueron analizadas en su capacidad de complementar ciertos genes nif o ntr de cepas mutantes de A. vinelandii (93) o por hibridación de los genes nif de otros diazótrofos. Con estas estrategias se logró el aislamiento de los genes nifHDK, nifA, nifB, nifV, nifE y ntrBC (78). El grupo de los genes nif y los involucrados en la fijación de nitrógeno han sido secuenciados y analizados. El análisis de las secuencias, alrededor de 30.5 kb, reveló el grupo de genes contiguos nif, fix y genes asociados más extenso reportado en la actualidad entre las bacterias diazótrofas (54). El análisis de la secuencia de los promotores en conjunto con ensayos tipo "Northern blot" indican que los genes de G. diazotrophicus están organizados dentro de ocho unidades transcripcionales. También se observó que los genes nif de G. diazotrophicus comparten características con los genes nif de otros diazótrofos, particularmente con miembros del subgrupo α-Proteobacteria. El orden de los genes nif en G. diazotrophicus es muy similar con el encontrado en Azospirillum brasilense (54).

Condiciones que afectan la fijación de nitrógeno en G. diazotrophicus

Algunas condiciones del entorno en las que se desarrollan los diazótrofos pueden afectar la capacidad de fijar nitrógeno, como por ejemplo la presencia de oxígeno y amonio. Se ha observado que el efecto de oxígeno sobre la actividad de la nitrogenasa depende del suplemento del carbono y de la tasa de respiración de las células (53). La sensibilidad de la actividad nitrogenasa de G. diazotrophicus al oxígeno y nitrógeno combinado depende de la concentración de sacarosa en el medio de cultivo (74). Una concentración del 10% de sacarosa favorece la expresión de la nitrogenasa aun en presencia de oxígeno, amonio y algunos aminoácidos. En el caso del nitrógeno combinado, la protección podría ser explicada por la baja asimilación de amonio que manifiestan las células de G. diazotrophicus cuando crecen con 10% de sacarosa. Este mecanismo resulta de gran interés considerando el habitat de G. diazotrophicus, normalmente rico en sacarosa, por lo que su nitrogenasa podría estar activa aún cuando la bacteria se encuentre rodeada de amonio (74). Algunas características del sistema respiratorio de G. diazotrophicus han sido analizadas (31). Se ha observado que al aumentar la aereación se provoca un fuerte efecto positivo sobre el crecimiento y la actividad de cultivos diazotróficos. Las células de estos cultivos poseen un sistema de transporte de electrones muy activo, unido a membrana, con deshidrogenasas para NADH, glucosa y acetaldehído como principales donadores de electrones. Se sugiere que la glucosa deshidrogenasa y la citocromo ba son componentes clave en el sistema respiratorio de G. diazotrophicus en la diazotrofía aeróbica (31). G. diazotrophicus posee una pirroquinolina quinona unida a la glucosa deshidrogenasa (PQQ-GDH), la cual parece desempeñar la función de proveer energía extra a las células durante el proceso de fijación de nitrógeno (36).

Levanosacarasa y su posible función biológica

Se ha observado que las células de G. diazotrophicus no son capaces de transportar la sacarosa a su interior, razón por la cual se sugirió que la bacteria debería tener una enzima extracelular con actividad sacarolítica que le permitiera metabolizar esta fuente de carbono (1). Posteriormente se demostró que G. diazotrophicus es capaz de producir y secretar una proteína con actividad de levanosacarasa, la cual se expresa en forma constitutiva (42, 43). Esta proteína representa mas del 70% de las proteínas totales secretadas por la cepa SRT4 de G. diazotrophicus (42). La levanosacarasa es una proteína de 58 kD con punto isoeléctrico de 5.5, la cual expresa su actividad óptima a pH 5.0 (42). Esta enzima cataliza la transfructosilación de la sacarosa a una variedad de aceptores incluyendo agua (hidrólisis de sacarosa), glucosa (reacción de intercambio), fructano (reacción de polimerización) y sacarosa (síntesis de oligofructósidos). El gen que codifica para la levanosacarasa (lsdA) fue aislado a partir de una librería genómica construida con la cepa SRT4 de G. diazotrophicus y detectada por complementación de una cepa mutante de G. diazotrophicus deficiente en la síntesis de levanosacarasa (2). La interrupción de este gen resultó en una mutante deficiente en la actividad levanosacarasa y en la capacidad de utilizar glucosa como única fuente de carbono, demostrando que la levanosacarasa es una enzima clave en el metabolismo de la sacarosa (2). El gen lsdA contiene 1751 pb y codifica para una proteína de 64.9 kD con punto isoeléctrico de 5.2, sugiriéndose que es una proteína precursora que se rompe para dar lugar a la proteína madura. La expresión del gen lsdA en E. coli con un promotor lac resultó en la producción de una proteína con actividad de levanosacarasa. En estudios de microscopia electrónica se observó que la LsdA, detectada mediante el uso de estrategias inmunológicas ("inmunogold"), se acumula en el periplasma antes de su secreción (41). Las formas periplásmicas y extracelulares de la enzima fueron purificadas y ambas exhibieron características bioquímicas y físicas similares, indicando que la LsdA adopta su conformación final en el periplasma. En contraste con otras bacterias gram negativas, G. diazotrophicus secreta una levanosacarasa por un mecanismo dependiente del péptido señal (41). La estructura primaria de la levanosacarasa producida por esta bacteria ha sido caracterizada con el uso de la espectrometría de masas (10).

Considerando que la cepa SRT4 fue identificada como un miembro del tipo electroforético ET 1, esta cepa fue comparada en su actividad de levanosacarasa con cepas representativas de los diferentes tipos electroforéticos aisladas de la mayoría de los hospederos conocidos de G. diazotrophicus (43). Se observó que existe un alto grado de conservación de la levanosacarasa en las 14 cepas analizadas, las cuales representan 11 diferentes tipos electroforéticos de G. diazotrophicus. Sin embargo, fue observado que la producción de levanosacarasa es tres veces mas elevada en las cepas aisladas de plantas ricas en sacarosa (e.g. caña de azúcar y piña) que en las cepas aisladas de la planta del cafeto (43). Además, en este estudio se confirmó que la enzima levanosacarasa hidroliza la sacarosa y da origen a oligofructanos y levana, los cuales pudieran prevenir la respuesta defensiva de la planta como se ha sugerido que ocurre con las bacterias patógenas Erwinia amylovora (38) y Pseudomonas syringae (50) y/o favorecer a la bacteria durante la colonización de la planta, como se ha observado con Paenibacillus polymyxa (4). Mediante microscopía electrónica en conjunto con el uso de anticuerpos de tipo policlonal dirigidos contra G. diazotrophicus ha sido observada la presencia de un exopolisacárido, el cual se sugiere está involucrado con la actividad sacarolítica o en señales clave en la interacción de G. diazotrophicus con su hospedero (47).

Colonización de hospederos por G. diazotrophicus

Aun cuando G. diazotrophicus sobrevive pobremente cuando se inocula artificialmente en suelo (6, 46) se ha logrado su aislamiento de la rizosfera del cafeto en frecuencias hasta del 40% cuando el pH del suelo es ácido (49). Se ha sugerido que la colonización de la rizosfera del cafeto se debe a la abundancia de materia orgánica presente en este ambiente, la cual contribuye con fuentes de carbono asimilables por G. diazotrophicus y además le proteje de las condiciones fisicoquímicas adversas del suelo. Esto contrasta fuertemente con la pobreza de materia orgánica observada en los suelos cultivados con caña de azúcar debido a la quema que se lleva a cabo en este cultivo previo al corte. A pesar de que G. diazotrophicus no se ha logrado aislar de especies de plantas asociadas con la caña de azúcar o de especies de pastos, ni de plantas de arroz, maíz y sorgo cultivadas en el campo (13, 55, 76), se ha observado que esta bacteria tiene la capacidad de colonizar tanto la región de la epidermis, así como el cortex y el interior de los vasos de xilema de raíces de maíz cuando es inoculada artificialmente (20).

Los estudios de colonización y localización de un microorganismo endófito asociado con su hospedero contribuyen a confirmar la naturaleza endófíta del microorganismo, así como ubicar el sitio probable donde expresa algunas de sus funciones biológicas que pudieran contribuir con el desarrollo de la planta. Los estudios de colonización de los tejidos internos de las plantas por G. diazotrophicus se han llevado a cabo mayoritariamente con la caña de azúcar.

G. diazotrophicus es capaz de colonizar la superficie de raíces de caña de azúcar y de penetrar a través de los sitios de emergencia de las de las raíces laterales, así como a través de la región meristemática de las raíces (47). También se ha descrito que la entrada de G. diazotrophicus a la planta de caña de azúcar involucra estructuras similares a los hilos de infección formados por Rhizobium (8), sin embargo, estas observaciones no han sido confirmadas en ningún otro estudio posterior. Los sitios que coloniza G. diazotrophicus y su distribución en el interior de la planta de caña de azúcar han sido motivo de controversia entre los diferentes grupos que han investigado ésta asociación. Con el uso de estrategias diferentes, inmunológicas o moleculares y el auxilio de microscopia electrónica (Fig. 10), fue demostrado que G. diazotrophicus coloniza los espacios intercelulares de la raíz y los vasos del xilema de plántulas de caña de azúcar de 15-30 días de edad, obtenidas por micropropagación (47) o por propagación vegetativa del tallo (34). En contraste, los estudios de Dong y col. (27) señalan que G. diazotrophicus se localiza en los espacios intercelulares del tallo correspondientes al apoplasto de plantas adultas de caña de azúcar, obtenidas a través de la propagación vegetativa de tallos. Sin embargo, en este estudio la propuesta se basa en el hecho de haber aislado la bacteria en medios de cultivo inoculados con muestras de líquido obtenido del apoplasto, pero no se muestra ninguna evidencia que indique la presencia de G. diazotrophicus en el apoplasto. La pureza del líquido apoplástico usado ha sido cuestionada debido a las condiciones en que éste se obtuvo, ya que podría estar contaminado con savia del xilema (46). En apoyo a su propuesta, Dong y col. (27) argumentan contra la localización de G. diazotrophicus en los vasos del xilema, ya que la inoculación de la bacteria en la corriente de estos vasos provoca el taponamiento de los mismos debido a la producción abundante de "gomas" de color rojo. No obstante, en otros estudios no ha sido observada ninguna reacción de tipo patogénico en plantas de caña de azúcar inoculadas con G. diazotrophicus (34, 47, 75). La diferencia en la cantidad de células de G. diazotrophicus inoculadas y la forma de inoculación podría explicar la discrepancia entre observar o no una reacción de defensa de la planta.

La dispersión de G. diazotrophicus en el interior de la planta también ha sido motivo de controversia. En tanto que en algunos estudios se sugiere que G. diazotrophicus se dispersa en los tejidos internos de la planta a través de los vasos del xilema (34, 47, 75), en otro se objeta que estos vasos sean la vía de dispersión, argumentándose la existencia de barreras morfológicas que impiden la comunicación entre vasos del xilema de un internodo a otro (29). Una amplia argumentación a las diferencias de resultados sobre la localización de G. diazotrophicus en el interior de plantas de caña de azúcar se encuentran en los trabajos de Fuentes y col. (34) y James y col. (46). Consideramos que algunas de las discrepancias podrían ser producto de los métodos y condiciones que se han usado en los estudios, muy particularmente debido al origen del material vegetal de experimentación (microprogagado por cultivo de tejidos o propagación vegetativa de plantas adultas), así como a la edad de las plantas al tiempo del análisis, es decir, plantas con 15-30 días de edad o en plantas adultas.

Factores que afectan a la asociación G. diazotrophicus-planta hospedera

El establecimiento de G. diazotrophicus en sus diferentes hospederos dependerá de los factores que influyen directamente en la interacción bacteria-hospedero. En uno de los primeros estudios desarrollados con el objetivo de conocer la presencia de G. diazotrophicus entre variedades de caña de azúcar cultivadas en México fue observado que la frecuencia de aislamiento de esta bacteria se encontraba en relación inversa con los niveles de fertilización nitrogenada aplicados a los cultivos (35). Con dosis de fertilización de 275 a 300 Kg de N/ha la frecuencia máxima de aislamiento de G. diazotrophicus es de 2% pero comúnmente no se logra su aislamiento, sin embargo, esta frecuencia se incrementa hasta el 65% con dosis de fertilización de 120 Kg de N/ha. Trabajos posteriores han confirmado que las dosis elevadas de fertilizantes nitrogenados aplicados a los cultivos de caña de azúcar afectan a la población de G. diazotrophicus encontrada en diferentes variedades cultivadas en Brasil y la India (63, 14). La capacidad de G. diazotrophicus para colonizar a la planta de caña de azúcar creciendo con diferentes dosis de nitrógeno fue evaluada bajo condiciones de invernadero (34). Se encontró que el nitrógeno aplicado en forma de NH₄NO₃ afecta la capacidad de G. diazotrophicus para colonizar a la planta. Aparentemente el nitrógeno no ejerce un efecto directo sobre la bacteria sino a través de la planta, debido a los cambios drásticos que ocasiona el nitrógeno sobre la fisiología de las mismas (30). Por ejemplo, se han observado cambios en la concentración de sacarosa en el interior de la planta de caña de azúcar, dependiendo de la variedad y de la forma de nitrógeno aplicado (70). El efecto causado por las altas dosis de nitrógeno que se aplican a los cultivos parece que afecta también a otras poblaciones endófitas fijadoras de N₂ (52). Aún cuando se desconoce el mecanismo por el cual el nitrógeno afecta al establecimiento de algunos endófitos fijadores de nitrógeno, se advierte que la alta fertilización nitrogenada aplicada a los cultivos es una amenaza para el mantenimiento natural de estas asociaciones (34).

Con el objetivo de conocer aquellos factores que influyen en la asociación G. diazotrophicus-caña de azúcar hemos desarrollado algunos experimentos de inoculación en plántulas micropropagadas. Los resultados revelan que la edad de la planta y la variedad de caña de azúcar influyen fuertemente sobre el establecimiento de G. diazotrophicus (Muñoz-Rojas y Caballero-Mellado; resultados no publicados). A medida que aumenta la edad de la planta el número de células de G. diazotrophicus en los tejidos internos disminuye drásticamente, lo cual parece reflejar los cambios fisiológicos que experimenta la planta durante su crecimiento. Es conocido que las características morfológicas y fisiológicas difieren entre las variedades de caña de azúcar (57), por lo que nos parece importante determinar cuáles son las diferencias que permiten la mejor interacción con G. diazotrophicus y con otros endófitos.

Efecto de la inoculación de G. diazotrophicus sobre el crecimiento de la caña de azúcar

Frecuentemente, desde hace más de 10 años, se ha referido en múltiples publicaciones a G. diazotrophicus como la bacteria responsable, o al menos una de las más importantes, de la fijación de nitrógeno detectada en la caña de azúcar. Sin embargo, desde el descubrimiento de G. diazotrophicus y a pesar de que ha sido encontrado en asociación endófita con diferentes plantas, son escasos los experimentos desarrollados para conocer su efecto sobre el crecimiento vegetal, determinándose éste, entre sus hospederos naturales, solo en la caña de azúcar.

En condiciones de laboratorio, Sevilla y col. (80) observaron a los 30 días post-inoculación que tanto una cepa silvestre como una mutante no fijadora de nitrógeno (nif^-) de G. diazotrophicus promueven el crecimiento de plántulas micropropagadas de caña de azúcar en un medio con nitrógeno. Sin embargo, en ausencia de nitrógeno las plántulas inoculadas con la cepa silvestre tuvieron una altura significativamente mayor que las plántulas inoculadas con la cepa nif^- y que la mostrada por las plántulas testigo. Resultados similares fueron obtenidos a los 60 días después de la inoculación (79), pero además, el peso seco y el contenido de nitrógeno total de las plántulas inoculadas, tanto con la cepa silvestre como con la mutante, fueron significativamente mayores que el de las plántulas testigo crecidas en presencia de nitrógeno mineral. Estos autores consideran que G. diazotrophicus promueve el crecimiento de la caña de azúcar tanto a través de la fijación de nitrógeno como de otro mecanismo, sugiriendo la síntesis de ácido indol acético como el factor responsable.

En contraste con los datos publicados por Sevilla y col. (79, 80), los resultados de un experimento de invernadero llevado a cabo durante 6 meses, no revelaron ningún efecto sobre el crecimiento de plántulas micropropagadas de caña de azúcar inoculadas separadamente con 7 cepas diferentes de G. diazotrophicus, con la excepción de las plántulas inoculadas con una de las cepas (PAl 3) que mostraron mayor altura, estadísticamente significativa, en comparación con las plántulas testigo (Muñoz-Rojas y Caballero-Mellado, resultados no publicados). Sin embargo, el peso seco de estas plántulas no mostró diferencias estadísticas significativas respecto al peso seco de las plántulas evaluadas como testigo. La discrepancia entre los resultados observados en los experimentos de inoculación descritos podría deberse a las condiciones de experimentación diferentes.

A pesar que los reportes sobre experimentos de inoculación con G. diazotrophicus son tan escasos y que aparentemente su efecto sobre el crecimiento de la caña de azúcar es limitado, nos parece que esta bacteria puede ser considerada como modelo de estudio que contribuya a un mejor entendimiento de la asociación entre los endófitos y sus hospederos.

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