Brucella

Ahidé López Merino



Escuela Nacional de Ciencias Biológicas, Instituto Politécnico Nacional

El género Brucella, descrito en 1920 por Meyer y Shaw, está formado por bacterias parásitas intracelulares facultativas, que producen el aborto epizootico en muchas especies domésticas de animales y una enfermedad febril septicémica o infecciones focalizadas en el hombre.El descubrimiento del agente etiológico de la enfermedad, conocida como fiebre de Malta, se realizó a finales del siglo XIX, por un grupo de investigadores encabezados por D. Bruce. Con base en las características coloniales y microscópicas, la bacteria se denominó Micrococcus melitensis. Otros hallazgos de relevancia se presentan en la Tabla 1.

La enfermedad se conoce también como fiebre del mediterráneo, fiebre recurrente, brucelosis y fiebre del Río Grande, se ha mantenido como una de las zoonosis de mayor distribución e importancia en el mundo. Desde 1905 se acepta su existencia en México, aunque, el primer aislamiento de una cepa de Brucella melitensis se realizó, años después por Pláceres en Puebla. Ha causado y causa grandes pérdidas económicas a la ganadería del país y constituye uno de los más importantes problemas de la salud pública. Existe una preferencia marcada por el huésped animal, así se tiene que B. abortus infecta normalmente al ganado bovino, B.melitensis se relaciona mas con cabras y borregos, B. suis con cerdos, B. canis infecta perros, B. ovis causa infección específicamente a borregos y B. neotomae a roedores. El hombre es susceptible a cualquiera de las cuatro primeras especies, ya que se considera que B. ovis y B. neotomae poseen una baja virulencia que las restringe solo a ciertos huéspedes. (Fig.1) En años recientes, el amplio espectro de huéspedes de Brucella se ha ampliado al incluir a los mamíferos marinos. Se ha realizado el aislamiento de Brucella a partir de una amplia variedad de focas, leones marinos, delfines y ballenas, en las costas de diferentes continentes. Estas cepas, claramente forman un grupo separado al que, de modo no oficial, han denominado B. maris. Dentro del grupo se distinguen dos tipos: el formado por cepas provenientes de cetáceos y el de las cepas aisladas de focas.

Desde su descubrimiento y en estudios subsecuentes realizados, en la Isla de Malta y otras regiones en el mundo, la infección en el hombre, ha sido el mejor indicador de la existencia de la enfermedad en los animales. En éstos, las manifestaciones clínicas son poco aparentes y como la bacteria se aloja en el tracto reproductor en las hembras, el aborto, los partos prematuros y la retención de placenta son los únicos signos visibles padecimiento. En cambio, la enfermedad en el humano se manifiesta con un cuadro febril de curso prolongado, incapacitante, con severas complicaciones y que puede progresar hacia una enfermedad crónica.

Epidemiología de la Brucelosis humana

Al ser la brucelosis una zoonosis, la fuente de infección la constituyen los animales infectados que, en su mayoría son aquellas especies productoras de alimento. B. abortus está mas extendida en el mundo y probablemente en México, sin embargo, se aisla poco de casos humanos. La infección en el hombre es a menudo subclínica, y cuando presenta alguna sintomatología es, en general, menos severa que la causada por B. melitensis o B. suis. Las vacas y sus productos son la fuente de infección más común, aunque los perros también pueden jugar un papel importante en la epizootiología de la enfermedad en nuestro medio. Con base en los estudios bacteriológicos realizados en México, se conoce la existencia de los siguientes biovares de Brucella, 1, 4, 5 y 6, siendo el biovar 1 el más frecuente y el biovar 4, el más virulento para el hombre. B.melitensis es la especie que más se notifica como causa de enfermedad, se aisla con mayor frecuencia de los casos humanos, casi en un 90%. Es el tipo más virulento y está asociado a una enfermedad aguda severa. La bacteria infecta principalmente a cabras y borregos, pero otras especies no quedan exentas. En forma particular, la infección en vacas, se ha visto como un problema de gran trascendencia epizootiológica en algunos países del sur de Europa, del Medio Oriente y en México. La presencia de B. melitensis en bovinos es un problema potencialmente grave, por el gran volumen de leche infectada que se produciría por animal y por la contaminación que se vertería al medio ambiente con un solo aborto (alrededor de 1010 bacterias / ml). En el territorio nacional el biovar 1 es más frecuente, aunque en algunos casos se ha aislado el biovar 3 y el 2. B. suis se presenta como una infección más restringida. En forma local es una fuente importante de casos humanos, que pueden ser tan severos como los producidos por B. melitensis. En México solo se ha aislado el biovar 1, tanto de casos humanos como de cerdos. Los huéspedes animales, excretan gran cantidad de bacterias junto con los tejidos y otros productos del aborto; en menor medida por excreciones genitales que contaminan los sitios donde habitualmente se encuentran, en donde pernoctan o abrevan. De esta forma, se contamina con gran facilidad, el suelo, los traspatios, corrales, la paja de las camas, el agua de arroyos, canales y pozos. También la Brucella es excretada en la leche. En consecuencia el hombre la puede adquirir por exposición ocupacional, por contacto con medios ambientes contaminados, por consumo de alimentos contaminados o por transmisión de persona a persona.

El predominio de un mecanismo u otro dependerá de las condiciones socioeconómicas y características del medio social que se considere. En los países que tienen un mejor nivel sanitario, la enfermedad es de carácter casi exclusivamente profesional, mientras que en los menos desarrollados, una parte importante de los casos corresponde a la población general, que adquiere la infección a través de la ingesta de productos lácteos no controlados, principalmente leche y queso fresco. Las personas se infectan al inhalar polvo o pelo contaminado, por salpicaduras en la conjuntiva, por ingestión accidental, a través de abrasiones o cortaduras de piel o por auto inoculación accidental de sangre del animal infectado o de vacunas vivas. Es difícil determinar hasta que grado el paso de los animales por ciertos caminos o rutas pobladas puede producir contaminación de calles, patios, mercados, etc. En forma particular cuando se presente un aborto ¿cuál va a ser el impacto en esa zona?. Especialmente en el caso de Brucella spp que puede sobrevivir por períodos prolongados en el polvo, estiércol, agua, fetos, suelo, carne y productos lácteos. En otro contexto, al ser las brucellas eliminadas en forma intermitente con la leche, el alimento, se vuelve una fuente de infección para la población que la consume sin ningún tratamiento térmico preliminar. La población rural como la urbana se verá afectadas, la urbana con mayor capacidad de compra tendrá un riesgo mayor. La manufactura de quesos concentra en buena medida a las bacterias que pueden sobrevivir en esas condiciones algunos meses. Lo mismo sucede en el caso de la mantequilla, crema o helados preparados con leche contaminada. El consumo de carne cruda o mal cocida, proveniente de animales infectados, representa un riesgo menor, ya que el músculo contiene baja cantidad de brucelas. En cambio las vísceras, la ubre y los testículos contienen cantidades importantes de bacterias. La sangre fresca es potencialmente peligrosa para aquellos individuos que acostumbra consumirla natural o mezclada. (Fig.2).

La transmisión de persona a persona es muy rara, en los casos reportados solo existe evidencia circunstancial que sugiere que la transmisión se produjo por vía sexual. De mayor importancia es la infección como resultado de una transfusión de sangre o de un transplante de tejido. El que representa un riesgo mayor es la médula ósea.Otra forma de transmisión es de la madre con brucelosis aguda al hijo a través de la leche materna o de la placenta produciendo aborto o brucelosis en el recién nacido.

En México, desde hace ya varios años la brucelosis se presenta tanto en población rural como urbana, de ambos sexos, económicamente activa, entre 20 y 45 años de edad con mayor número de casos en mujeres. Los niños de alrededor de 10 años son una población en riesgo creciente.

Metodos de aislamiento y caracteristicas de cultivo

En general, los medios que se emplean para el cultivo de Brucella contienen peptonas o triptonas a las que se adiciona extracto de levaduras, suero o sangre para favorecer el crecimiento de estas bacterias. Existen medios comerciales, cuya formulación reúne estos requisitos. Las muestras de sangre, médula ósea y de líquido cefalorraquídeo de preferencia se inoculan en botellas con medio doble (Ruiz Castañeda modificado). Cuando aparece crecimiento visible, en la superficie del agar a las 24 h de incubación, se descarta la botella y se toma otro cultivo. Brucella se desarrolla al cabo de 4-5 días. En algunos casos, la aparición de crecimiento es tardía (6 semanas). Las resiembras se realizan con ayuda de una jeringa, que evita el abrir la botella. Se siembra por duplicado en placas de agar sangre al 10%, en agar soya tripticasa (TSA) con extracto de levaduras al 0.5% y en agar Mac Conkey. Una serie se incuba en atmósfera de CO2 y la otra en atmósfera normal a 36º C. Al cabo de cuatro días, debe de observarse crecimiento visible en alguna de las series si existen brucelas viables.

En algunos casos de brucelosis crónica se ha reportado el aislamiento de colonias en forma L que están formadas, por bacterias con pared celular modificada inducida entre otros factores por antibióticos como la penicilina. Estas colonias son visibles al microscopio esteroscópico (Fig. 3), son muy frágiles, por lo que pueden pasar inadvertidas si no se emplean los medios de cultivo adecuados y se realiza una búsqueda de ellas. Preferentemente crecen en el menisco que se forma entre la fase líquida y sólida del hemocultivo.

Identificación

Morfología microscópica.- Bacilos cortos pequeños Gram negativos de 0.5 X 0.5 hasta 1.5 μm de longitud (Imagen de la Tinción de Gram). Al emplear la tinción de Zielh-Neelsen modificada, las brucelas se tiñen de color rojo y se observa la misma morfología. Otras bacterias se verán verdes.

Morfología colonial.- En medio TSA, las cepas lisas (S) producen colonias circulares, convexas con bordes regulares, translúcidas y coloración ámbar. A la luz reflejada son brillantes, ligeramente opalescentes y de color gris azulado (Fig. 4).

En gelosa sangre no produce hemólisis, en agar Mac Conkey crecen poco y no fermentan la lactosa.

Las cepas rugosas (R), el TSA, producen colonias semejantes en la forma pero varían considerablemente en tamaño, color, consistencia y textura (Fig. 5).

En las cajas de TSA, se aconseja determinar la producción de catalasa y oxidasa, para las cuales las brucelas son positivas. Inmediatamente se procede a aglutinar a las colonias sospechosas con suero polivalente anti Brucella. Se recomienda realizar la suspensión de brucelas en solución salina fenolada al 1.0% extremando las precauciones. Si hay aglutinación, muy probablemente se trate de bacterias del género Brucella.

Para identificar la especie y el biovar se procede a efectuar las siguientes pruebas bioquímicas especiales:

Requerimientos de CO2. Inmediatamente después del primer aislamiento, la cepa en estudio se siembra por triplicado en tubos con agar soya triticasa y extracto de levaduras inclinados. Se incuban dos tubos en atmósfera de CO2 y el otro en atmósfera normal, a 36º C por 48 h antes de que se desarrollen mutantes independientes de CO2. Con el crecimiento de uno de los tubos, se prepara una suspensión de bacterias para inocular el resto de medios de cultivo:

Medio de Kligler.- ausencia de ácido y gas a partir de glucosa y lactosa.

Medio de urea de Christensen.- Medir el tiempo en que vira el medio a rojo, debido a la producción de ureasa. Brucella suis produce la mayor cantidad de ureasa y un tiempo muy corto comparada con las demás especies que producen menor cantidad. (Fig. 6)

Tubo inclinado con agar soya tripticasa, con una tira de papel filtro impregnado con acetato de plomo sujetado por la contratapa o el tapón de algodón para observar la aparición de H2S por el ennegrecimiento de la tira de papel filtro (Fig. 7).

Citrato de Simmons.- No emplea este substrato como fuente de carbono, por lo que no se modifica el color verde .

Medio de SIM.- Observar la inmovilidad de las brucelas y la ausencia de indol y H2S en este medio.

Crecimiento en presencia de colorantes. Se siembra en dos colorantes: tionina y fucsina básica como se muestran en la imagen. (Fig. 8, 9)

Existen otras pruebas consideradas como especiales, debido a que solo se realizan en laboratorios de referencia especializados en estas bacterias.

Susceptibilidad a bacteriófagos.- Sobre una capa de Brucella sembrada en forma masiva, se coloca una gota pequeña de cada uno de los bacteriófagos Tbilisi (Tb), Weybridge (Wy) y Berkeley (Bk), se observa la existencia de lisis en los sitios en donde se colocaron las gotas.

Aglutinación con sueros monoespecíficos.- Se emplean el suero monovalente A y en monovalente M. El R se utiliza solo cuando se sospecha de B. canis o de otra especie rugosa natural. Al realizar esta prueba es muy importante tomar en consideración lo siguiente:

· B. abortus puede contener antígeno A (biovar 1,2,3 y 6) o antígeno M (biovares 4,5 y 9) en forma de antígenos dominantes o ambos antígenos A y M (biotipo 7) en forma igualmente dominante.

· B. suis puede tener antígeno A (biotipos 1,2 y 3) como antígeno dominante o ambos A y M (biotipo 4).

· B.melitensis puede tener antígeno M (biotipo 1) o antígeno A (biotipo 2) como antígenos dominantes o ambos A y M (biotipo 3). Por consiguiente, cualquier cepa que aglutine con suero mono específico M, no es necesariamente B. melitensis; éste es un error que frecuentemente se comete, por desconocer la composición antigénica de los diferentes biovares de Brucella.

Las consideraciones anteriores hacen que esta prueba deba ser efectuada e interpretada por personal con experiencia (Tabla 2).

Resistencia y supervivencia

Brucella es una bacteria que posee una gran capacidad para sobrevivir y persistir en el ambiente bajo condiciones apropiadas, si se compara con muchas otras bacterias patógenas no esporulantes. Bajo condiciones adecuadas de temperatura, humedad y protección contra el sol las brucelas pueden sobrevivir en ambientes diversos por largos períodos aunque no existe evidencia de que los organismos se repliquen significativamente bajo estas condiciones en el suelo, agua o estiércol. En los restos de animales congelados, las bacterias sobreviven por muchos años. Cuando se desecan en presencia de exceso de proteínas y se protege de la luz solar, pueden retener su infectividad por muchos años. En la Tabla 3 se resume el tiempo que permanecen viables algunas especies, en diferentes medios.

En contraposición, son bastante sensibles al calor, así una suspensión diluida de brucelas, se destruye rápidamente al ser sometida a la pasteurización o al exponerla a temperaturas de 60° C por 30 minutos. Sin embargo, una suspensión densa es mas difícil de inactivar y se debe de prolongar el tiempo de exposición al calor o someterla a temperaturas mas elevadas. Brucella es muy sensible a la radiación ionizante y se mueren con rapidez al exponerla a la luz ultravioleta. También son sensibles, a la mayoría de los desinfectantes de uso común, a las concentraciones recomendadas. Como sucede en otras bacterias, la susceptibilidad se reduce en presencia de materia orgánica o a bajas temperaturas. El etanol, isopropanol, iodóforos, hipoclorito diluido y los fenoles sustituidos son eficaces para desinfectar la piel expuesta a Brucella.

En general, Brucella es susceptible a la mayoría de los antibióticos, como lo muestran los trabajos publicados, en la mayoría se realizaron ensayos in vitro empleando diferentes métodos: las sulfonamidas, los aminoglicósidos como la estreptomicina, gentamicina, kanamicina, amikacina, tobramicina; las tetraciclinas, cloranfenicol, eritromicina, novobiocina, rifampicina y quinolonas como norfloxacina, ciprofloxacina y esparfloxacina, son todos ellos activos contra Brucella a concentraciones bajas, como lo muestra la concentración mínima inhibitoria reportada, para cada uno de ellos en diferentes estudios. Los antibióticos beta-lactámicos son los menos efectivos con excepción de la ampicilina, que presente mayor efecto in vitro. Las cepas en general muestran gran variación en la susceptibilidad a estos antibióticos.

Anatomia microscópica y composicion quimica

La anatomía microscópica de Brucella es sustancialmente semejante a la estructura clásica de las bacterias Gram negativas. Al microscopio electrónico se distinguen, de fuera hacia dentro: la envoltura celular, integrada por la membrana externa, el espacio periplásmico y la membrana citoplasmática que rodea al citoplasma.

La membrana citoplásmica consiste de una bicapa de fosfolípidos y proteínas de diversos tipos, es una estructura muy vulnerable a los cambios osmóticos y del medio ambiente. Entre la membrana citoplásmica y la membrana externa se encuentra el espacio periplásmico y la capa de peptidoglicana. La composición de la membrana externa de Brucella es semejante a la de E. coli. La región apolar (hidrofóbica) de la membrana con un grosor de 4.5 nm, forma una barrera estructural y funcional entre el periplasma y el exterior de la célula. La peptidoglicana se encuentra fuertemente asociada a la membrana externa a través de moléculas de lipoproteina unidas por ligadura covalente, ésto le proporciona una mayor estabilidad. (Fig. 10) La lipoproteína de Brucella es estructuralmente semejante a la lipoproteína de Braun de E. coli y existe cruce serológico entre ellas. Además existen otras proteínas asociadas en forma no covalente a la peptidoglicana. Las proteínas llamadas porinas funcionan como canales transmembranales, que permiten la difusión de compuestos entre ciertos límites de peso molecular (límite de exclusión).

La membrana externa, constituye la barrera física y funcional entre el interior de la célula bacteriana y su medio, además de ser, la primera estructura que entra en contacto con las células del sistema inmunológico del huésped, durante los estadios tempranos de la enfermedad, ya que no se han descrito componentes capsulares en Brucella. Por otro lado, la supervivencia de la bacteria ya sea en el medio ambiente o en el huésped, depende de la integridad de su membrana externa; ya que si ésta sufriera algún daño, la bacteria no sobreviviría por mucho tiempo.

De los constituyentes de la membrana externa (ME) de Brucella, el mas estudiado ha sido el lipopolisacárido (LPS) por ser el mas externo, abundante y antigénico, se le conoce también como endotoxina. Sus propiedades bioquímicas y biológicas son diferentes a las del resto de bacterias Gram negativas, especialmente en cuanto al contenido de ácidos grasos del lípido A. La endotoxina de Brucella presenta baja actividad endotóxica aunque conserva sus propiedades inmunogénicas (Fig. 11).

Las cepas en fase lisa (S), poseen el S-LPS que está constituido de un lípido A, formado de diferentes ácidos grasos; una región central (núcleo) que contiene el ácido 2-ceto 3-desoxioctulosónico, glucosa, manosa y quinovosamina; y una cadena O, proyectada hacia el exterior de la ME, constituida de un homopolímero de alrededor de 100 unidades de 4-formamido-4,6-didesoximanosa (perosamina). Las cepas con epitopo A dominante (B. abortus bv. 1) contienen un polímero de cinco perosaminas unidas por ligadura α-1,2 y con una cierta proporción (dependiendo de la cepa), de unidades ligadas por unión α-1,3; mientras que las cepas que son M dominante (B. melitensis bv. 1), presentan unidades repetidas de un pentasacárido constituido de una perosamina unida por ligadura α-1,3 y cuatro unidas por ligadura α-1,2. Las diferentes ligaduras influyen en la forma del epitopo del LPS, así el tipo A dominante tiene forma de barra mientras que el tipo M dominante es retorcido (rizado).

Esta semejanza estructural tiene gran importancia práctica, ya que, al inocular una cepa de B. abortus en un animal de experimentación, el antisuero obtenido, reaccionará principalmente con cepas A dominante, con A/M y en menor grado con M dominante, lo que significa que, reaccionará en diferente magnitud, con todas las especies de Brucella en fase lisa (B. abortus, B. suis y B. melitensis), a menos que el antisuero sea adsorbido con suspensiones de B. melitensis para eliminar los epitopos M y obtener un suero A monoespecífico. En consecuencia, lo mismo sucedería al inocular cualquier cepa de Brucella.

La presencia de moléculas de perosamina en el LPS de algunas bacterias Gram negativas, es responsable de la actividad antigénica cruzada que se observa con: Escherichia hermanni y E. coli O:157, Salmonella O:30, Stenotrophomonas maltophilia, Francisella tularensis y Vibrio cholerae O:1. Yersinia enterocolitica O:9, contiene una cadena O idéntica a la de B. abortus así como algún determinante M. Este hecho debe tomarse muy en cuenta al realizar el diagnóstico por métodos serológicos, ya que con frecuencia se producen errores y no se establece un buen diagnóstico diferencial, se trate de animales o de humanos.

La estructura del LPS de cepas rugosas (R-LPS), es básicamente similar al S-LPS, excepto por la cadena O, que está ausente o reducida a unos pocos residuos. Por lo que, la especificidad del R-LPS estará determinada por el polisacárido del núcleo (Fig. 12).

Hace algunos años se aceptaba la existencia de otros polisacáridos: el hapteno nativo (HN) y el polisacárido B (PB), el primero, aislado de cepas en fase lisa, se deriva del rompimiento hidrolítico del S-LPS, por lo que es estructuralmente indistinguible del polisacárido O. Mientras que el PB, obtenido de la cepa mutante en fase rugosa, B melitensis 115, en una glucana cíclica, serológicamente inactiva a menos que se encuentre asociada a residuos de cadena O. En conclusión los únicos antígenos polisacarídicos de importancia serológica en Brucella son: los polisacáridos A y M y la forma libre de la cadena O.

A diferencia de las enterobacterias, la ME de Brucella es rica en fosfatidilcolina y no en fosfatidil etanolamina, ésto explicaría en parte la resistencia que presenta a la polimixina B, además de que el antibiótico no se une al LPS.

Las proteínas de membrana externa (OMPs) son de gran interés porque las han relacionado con la protección. Las que primero se describieron fueron las proteínas mayores de 25-27, de 31-34 y de 36-38 kDa. Las que, posteriormente, formaron los grupos 3 (25-27) y 2 (36-38). Las proteínas del grupo 2 fueron identificadas como porinas; a las del grupo 3, se les consideró equivalentes a las OmpA de E.coli, con base en su similitud en la composición de aminoácidos y a su relación antigénica. El grupo 1 lo formaron proteínas con pesos moleculares de 88 a 94 kDa, cuya concentración fue menor a la de los otros grupos. En la actualidad, como resultado de la clonación y secuenciación de los genes que codifican para estas Omps, se les ha ido asignando otra nomenclatura: Omp25 , Omp31 y Omp2b. Otras Omps han sido, posteriormente identificadas por medio de anticuerpos monoclonales, por ser menos abundantes, se denominan proteínas menores y presentan masas moleculares de 10,16.5 19 y 89 kDa. Con base en estudios genéticos y de su secuencia de aminoácidos, las de 10, 16.5 y 19 kDa, se han identificado como lipoproteínas de membrana externa, denominándolas Omp10, Omp16 y Omp19, respectivamente. La Omp 16, pertenece a la familia de lipoproteínas asociadas a la peptidoglicana presentes en bacterias Gram negativas. Aparentemente existen proteínas homólogas a las Omp10 y Omp19 en Ochrobactrum anthropi y otras bacterias relacionadas genéticamente a Brucella. La Omp1 de 89 kDa se encuentra expuesta en la superficie de la célula. Finalmente, se ha puesto de manifiesto la existencia de acuaporinas en la ME, que son proteínas transmembranales con canales para agua y que pertenecen a la familia de las proteínas intrínsecas mayores.

Las Omp mayores o principales se encuentran expuestas en la superficie de la membrana externa, sin embargo, estarían menos accesibles en las cepas lisas que en las rugosas, debido al impedimento estérico que causan las largas y abundantes cadenas O del LPS en las cepas lisas.

Otras proteínas han sido descritas como la periplásmica BP26; de entre las internas se tiene el componente A2, que es una glicoproteína resistente al calor, empleada en el diagnóstico de bovinos; las de 16 a 18 kDa usadas como antígenos en reacciones intradérmicas; la proteína citoplásmica de 18 kDa, con secuencia descrita.

Numerosas proteínas de membrana externa, interna, citoplásmicas y periplásmicas han sido caracterizadas. Algunas son reconocidas por el sistema inmune, durante la infección y solo se han reportado en Brucella, por lo que serían de gran utilidad en futuras pruebas diagnósticas o para ser consideradas en las nuevas vacunas.

Genética

Brucella está constituído de un grupo muy homogéneo de bacterias, puesto de manifiesto por su relación antigénica y por estudios de hibridación ADN-ADN (> 90% de homología para todas las especies). Con base en el análisis de las secuencias del ARN ribosomal 16S, se ubicó a Brucella en el grupo alfa, sugrupo 2 de las Proteobacterias dentro de la familia Rhizobiaceae. Esta familia incluye bacterias patógenas de plantas y animales como Agrobacterium, Bartonella y Brucella, bacterias con capacidad para intreractuar con células eucarióticas en forma intercelular o intracelular; bacterias endosimbiontes de plantas como Rhizobium, y Phyllobacterium; habitantes del suelo como Mycoplana y a Ochrobactrum anthropi que es una bacteria del medio ambiente asociada a infecciones oportunistas en el hombre. Se caracterizan por poseer multiples replicones y plásmidos y capacidad para crecer intracelularmente. Cabe mencionar que Brucella contiene dos cromosomas o replicones circulares independientes de 2.1 y 1.15 Mb.

Existe evidencia limitada en cuanto a la recombinación genética entre los miembros del género Brucella. La conjugación no ha sido demostrada, ni tampoco se han encontrado las estructuras asociadas con ella como son los pilis. La transducción se puede llevar a cabo, la resistencia hacia algunos antibióticos se transfiere después de una infección fágica. No se han encontrado plásmidos nativos en Brucella ni a la fecha hay evidencia indirecta de su existencia. Las cepas de Brucella se pueden transformar empleando plásmidos de amplia especificidad derivados de Escherichia coli. Así, la resistencia a tetraciclina ha sido transferida a B. abortus por medio de un plásmido. La eficacia de transformación fue baja, sin embargo este antecedente indica la posibilidad de que dicho proceso ocurra bajo condiciones naturales.

Bacteriófagos.- Desde 1950, se sabe de la existencia de bacteriofagos de Brucella, el primero que se aisló por ser estable, fue el Tbilisi (Tb). A partir de entonces se han aislado muchos mas con tipos similares. Han sido clasificados en seis grupos, sobre la base de la especificidad de huéped.

Todos los fagos de Brucella, hasta ahora estudiados, contienen ADN y pertenecen al grupo Pedoviridae. Todos están intimamente relacionados y son similares en su morfología general y en la resistencia a agentes físicos y químicos.

Su aplicación principal ha sido, al emplearlos como un método sencillo para diferenciar las especies de Brucella. Sin emabargo, hay poca información disponible en cuanto a la naturaleza de los receptores en la superficie de la célula. La capacidad que presentan las células de Brucella para adsorber fagos varía entre las diferentes especies y entre las fases coloniales del organismo. Por lo que, según la información disponible, probablemente los receptores se ubiquen en alguna proteína (s) asociadas al LPS.

Clonación de genes.- A la fecha se han descrito numerosos genes de Brucella, entre los que se pueden mencionar:

- Sistema de regulación de dos componentes, BvrR/BvrS, homólogo al descrito en patógenos de plantas (A. tumefaciens), que controla la invasión celular, el tránsito intracelular y la virulencia.

- Región VirB que contiene 11 genes muy similares a los de A. tumefaciens, que es esencial para la multiplicación intracelular y la virulencia en el ratón.

- Proteína BacA, que es requerida para mantener la infección crónica en el modelo ratón. Presente también en Sinorhizobium meliloti.

- Grupo que contiene 18 genes flagelares, que no se expresan en condiciones normales, ya que Brucella ha sido tradicionalmente inmóvil.

- Gene hfq, requerido para la resistencia al estrés en la fase estacionaria y multiplicación intracelular, importante en la virulencia.

- HtrA proteína de choque térmico semejante a proteasas de serina.

Es evidente que se contará en el futuro con mas información ya que se ha concluído el análisis de las secuencias del genoma de B. melitensis M16.

Patogenicidad

Las especies de Brucella son patógenas intracelulares facultativas, su virulencia está relacionada con la capacidad que poseen para:

resistir el efecto bactericida de los componentes del suero normal y

- adherirse, penetrar y multiplicarse en una gran variedad de células eucarióticas, tanto fagocíticas como no fagocíticas.

La localización intracelular las mantiene protegidas de los antibióticos y de factores bactericidas del plasma como complemento y anticuerpos, lo que determina la naturaleza crónica de la infección.

La capacidad de producir ureasa aparentemente juega un papel en la colonización del huésped, a través de la ruta gastrointestinal. La enzima degrada la urea modificando el pH en el sitio en donde se encuentre la bacteria. Además, la bacteria se adhiere con cierta facilidad a la superficie de las mucosas, su gran hidrofobicidad tendría que ver en ello, ya que Brucella no posee ni fimbrias ni cápsula; ambas características favorecerían la colonización y la generación de la enfermedad. Por otro lado, alguno de sus componentes celulares (con función de adhesina), promovería específicamente la adherencia a receptores específicos de la célula huésped. La unión sería necesaria para inducir una serie de señales intracelulares, que faciliten la colonización e invasión celular. En el caso de los linfocitos humanos, Brucella se une a la membrana celular a través de moléculas semejantes a lectinas, en otras células, se sospecha de la existencia de un receptor, que no ha sido aún caracterizado.

En años recientes, se han tratado de dilucidar las vías que emplea Brucella para penetrar al interior de las células, para al final localizarse en el retículo endoplásmico. Se ha postulado una ruta, empleando células HeLa. Una vez fagocitada la bacteria, aparentemente por un proceso de fagocitosis tipo "cremallera", los eventos, se suceden de la siguiente forma: el fagosoma que contiene la bacteria, interactúa con endosomas tempranos (tanto en células HeLa como en macrófagos peritoneales de ratón). Este suceso ya había sido observado durante la fagocitosis de Mycobacterium tuberculosis y avium. Después, de una estancia transitoria en los endosomas tempranos, pasa a otro compartimiento, el endosoma tardío, de ahí se dirige a otro compartimiento con características de vesícula autofágica. La autofagia es una vía ampliamente usada para mantener la homeostasis celular. Bajo ciertas circunstancias la célula secuestra organelos o citoplasma en autofagosomas nacientes, que adquieren enzimas degradativas al fusionarse con lisosomas, con lo que se degrada su contenido. Los autofagosomas con brucelas entran a un proceso de maduración, que entre otros eventos produce una acidificación al interior de la misma; las bacterias no se replican en los autofagosomas. La replicación se lleva a cabo en compartimientos que conservan las propiedades funcionales del retículo endoplásmico. La ubicación de Brucella en el RE de la célula huésped, pudiera ser una estrategia que le permitiría obtener metabolitos sintetizados o translocados al RE, en forma de péptidos pequeños, esenciales para su crecimiento (Fig. 13).

El sistema regulador de dos componentes BvrS-BvrR de Brucella es esencial para la invasión de la célula huésped y para la virulencia in vivo. El sistema también percibe los estímulos intracelulares y una de sus funciones es que la bacteria llegue al autofagosoma. Cuando son fagocitadas por células polimorfonucleares (PMN) o por células fagocíticas mononucleares, (Fig. 14) las brucelas se multiplican dentro de fagosomas, en el interior de los cuales, despliegan diversos mecanismos que bloquean o suprimen la respuesta bactericida de estas células.

El lipopolisacárido liso (S-LPS) probablemente juega un papel importante, de forma natural las cepas lisas son más patógenas que las cepas rugosas, las cuales poseen virulencia reducida, sin embargo, existen en la naturaleza cepas rugosas que son patógenas, como B. ovis y B. canis y cepas lisas con virulencia reducida como B. neotomae. Lo anterior sugiere que el LPS no es la única molécula involucrada en la virulencia y que existen otros factores como las proteínas superficiales que pueden participar en la interacción de Brucella con su célula huésped.

Por otro lado, se sabe que B. abortus escapa a la muerte dentro de los PMN, al producir guanosina 5' monofosfato (GMP) y adenina que inhiben la fusión fagosoma-lisosoma, la desgranulación y la activación del sistema mielo- peroxidasa-haluro y la producción del factor de necrosis tumoral. Además, [] produce Cu-Zn superoxido dismutasa, que probablemente participa en las fases tempranas de la infección intracelular.

Dentro del macrófago, la bacteria debe de enfrentarse a condiciones adversas como el pH, falta de nutrientes y presencia de intermediarios reactivos del oxígeno. Brucella debe resistir estas condiciones de estrés, para poder establecerse en el compartimiento fagosomal. La supervivencia de Brucella dentro del macrófago, se ha asociado con la síntesis de enzimas antioxidantes (KatE y SodC) y proteínas de variados pesos moleculares: 17,24,28,60 y 62 kDa. La de 62 kDa, corresponde a la GroEL de choque térmico; las de 24 y de 60 kDa se inducen en medio ácido y su producción se relaciona con la supervivencia de Brucella en condiciones ácidas (pH<4). Las proteínas de 17 y 28 kDa se han relacionado con la supervivencia intracelular. La proteína HtrA, inducida por el estrés, está involucrada en la inducción de una respuesta granulomatosa temprana hacia B. abortus en el ratón. El papel de otras proteínas en la patogénesis de Brucella se desconoce, tal es el caso de las proteínas secuestradoras de fierro y de otros sideróforos. En general, a concentraciones bajas de fierro, se restringe el crecimiento microbiano y a elevadas se promueve la muerte de Brucella.

Los mecanismos que emplea Brucella spp para producir daño al huésped, aún no se conocen con detalle, aunque se acepta, que están muy relacionados con la permanencia intracelular de las bacterias, en donde se multiplican libremente sin causarle aparente daño a la célula. Esta ubicación intracelular, que la mantiene alejada de los antibióticos y de los componentes plasmáticos bactericidas como el complemento y los anticuerpos, probablemente determina la naturaleza crónica de la enfermedad.

Respuesta inmunológica

Como resultado de una infección por bacterias Gram negativas, las células del huésped se exponen principalmente a dos diferentes categorías de antígenos, el lipopolisacárido (LPS) y las proteínas, los que ejercen diferentes formas de activación del sistema inmune. Las proteínas bacterianas antigénicas inducen una respuesta inmune específica tanto celular como humoral con células de memoria funcionales. La primera es mas importante porque se le relaciona con la inmunidad protectora. Una vez que la bacteria es ingerida, los antígenos proteicos extraños se localizan en compartimientos intracelulares dentro de las células presentadoras de antígeno y se procesan hasta pequeños péptidos (de 8 a 12 residuos), y quedan listos para asociarse con moléculas del complejo principal de histocompatibilidad (MHC) de clase II. Estas moléculas presentadoras, que son heterodímeros, se translocan desde el retículo endoplásmico al aparato de Golgi antes de alcanzar la vía endocítica a través de la cual serán presentados en la superficie de la célula. De esta forma son reconocidos por los linfocitos T.

Las moléculas de carbohidratos y glicolípidos como el LPS, se consideran tradicionalmente como antígenos T- independientes, basado en observaciones que muestran que estas moléculas son capaces de activar linfocitos B, que inducen la producción de anticuerpos sin la aparente participación de las células T.

Los antígenos proteicos se presentan a células T cooperadoras (Th) con fenotipo CD4+, en general. Sin embargo, algunos antígenos de Brucella se expresan en el contexto del MHC de clase I, que provoca la activación de células T citotóxicas (Tc), con fenotipo CD8+. Las células Th incluyen a dos subpoblaciones que se distinguen entre ellas por sus funciones. Las Th1 que controlan la respuesta de tipo celular, por medio de ciertas citocinas, en cambio las Th2, controlan la respuesta de anticuerpos por el mismo mecanismo. Las células Th1 participan en forma directa en la protección hacía patógenos intracelulares, produciendo IFN-g que induce la activación de macrófagos con mayor capacidad bactericida. Ambas subpoblaciones regulan la producción de los diferentes isotipos de anticuerpos en forma selectiva al producir distintas citocinas.

Las células Th1 producen la citocina IFN-g, que es una, de las que mejor activa a los macrófagos, afortunadamente para el huésped, la respuesta inmune celular del tipo1, es apropiada para el control de la infección y la eliminación de la bacteria. Tanto estudios in vitro como in vivo, han mostrado que macrófagos activados con IFN-g , controlan la infección. Se ha sugerido, que el mecanismo sería, un incremento en la producción de intermediarios reactivos del oxígeno en los macrófagos activados por el IFN-g : El resultado sería el incremento de la resistencia del huésped a la infección.

En otro contexto, se considera que B. abortus es un fuerte inductor de inmunidad celular tipo 1, debido probablemente, a su capacidad para estimular la producción de IL-12 en macrófagos. La interacción del LPS con el receptor CD14 induce la producción de IL-12. La citocina IL-12 estimula células NK y T CD4 para que secreten IFN-γ, de esta manera influye en el desarrollo de células del tipo Th1.

Las células T CD8 además de que podrían también contribuir en la producción de IFN-γ tienen un papel adicional intrínseco a su fenotipo, que es el de lisar macrófagos infectados con brucelas y así matar a las bacterias intracelulares por medio de la granulocina o de alguna manera exponer a las bacterias a macrófagos activados con IFNγ (Fig. 15).

Brucelosis en el humano

En México, la mayoría de los casos de brucelosis humana, están relacionados al consumo de leche, queso fresco, crema y otros derivados sin pasteurizar. El periodo de incubación suele ser variable, en general, de 2 a 3 semanas, aunque puede prolongarse hasta algunos meses. De algún modo, éste depende de la virulencia de la cepa de Brucella, la dosis y del estado nutricional e inmune del individuo.

La brucelosis humana ha sido clasificada en forma arbitraria en varias categorías: subclínica, subaguda, bacterémica, aguda, recurrente, crónica, etc. Dichos términos reflejan el espectro de las manifestaciones clínicas pero complican mas el diagnóstico. La mayoría de los autores coinciden en considerar solo las fases aguda y crónica.

Por otro lado, la brucelosis típica en la etapa aguda, no siempre se identifica con facilidad, ya que los signos y síntomas podrían ser la expresión de otras enfermedades febriles comunes en nuestro medio. En consecuencia, se tienen que descartar enfermedades como salmonelosis, tifoidea, dengue, paludismo, tuberculosis, leptospirosis y otras que sean prevalentes en las zonas donde se presenten los casos.

Con base en la experiencia clínica de muchos años en nuestro medio, la brucelosis se clasifica como, aguda, subaguda, con recaídas y crónica cuando tiene mas de un año. El cuadro clínico no es característico, ya que se manifiesta como una cascada de signos y síntomas de naturaleza proteiforme. En la etapa aguda, la fiebre se presenta en el 95 a 98% de los casos, escalofríos (69-85%), diaforesis nocturna (85-88%) y en menor porcentaje: cefalea, anorexia, fatiga, mialgias, artralgias, y pérdida de peso. En algunos casos se presenta hepatomegalia (20-40%). Los leucocitos rara vez exceden los 10,000/mm3, pero la leucopenia y linfocitosis son características en pacientes bacteriémicos.

En la fase subaguda por lo general se realiza el diagnóstico de fiebre de origen oscuro, aunque la disociación del pulso temperatura puede orientar al diagnóstico de brucelosis. En ocasiones el único hallazgo clínico es la hepatoesplenomegalia, que hace sospechar de malignidad linfoide.

La recaída o recidiva, se presenta entre los 2 a 3 meses después de haber concluido el tratamiento instituido en un porcentaje de alrededor del 15% de los casos.

En la fase aguda, se pueden presentar complicaciones en 1-30% de los casos y menos del 1% se diagnostica. En consecuencia, no se administra tratamiento oportuno. Cuando la infección tiene mas de dos meses puede afectar cualquier órgano o sistema. La complicación esquelética es la que se presenta con mayor frecuencia, en la forma de sacroileítis, artritis periférica y espondilitis. En otros casos se puede encontrar neurobrucelosis, que se manifiesta en ocasiones, con cefalea persistente e intensa, así como meningoencefalits, mielitis, paresia depresión y psicosis. Se presentan además, otras complicaciones a nivel genitourinario, siendo la mas frecuente la epidídimo-orquitis lateral y luego la prostatitis y cistitis. En el riñón se puede desarrollar granulomas caseosos similares a los de la tuberculosis.

La endocarditis es poco frecuente (< 2%), sin embargo, es la causa del 85% de fallecimientos, es el resultado de un cuadro clínico subagudo, en el que se presentan anormalidades vulvares. En hígado, hasta el 90% de los casos se diagnostica hepatitis, con elevación de fosfatasas y transferasas. B. suis con frecuencia produce diminutos granulomas en hígado, difíciles de ubicar. También puede haber abscesos esplénicos y calcificaciones que ameritan cirugía. Existen muchas otras complicaciones como las hematológicas, oftálmicas y cutáneas.

La brucelosis crónica es una entidad mal definida, se diagnostica al conjuntar resultados del laboratorio con manifestaciones clínicas que se prolongan un mínimo de un año, con comienzo insidioso y predominio de formas viscerales, osteoarticulares y neurológicas, entre otras.

Existe también la forma subclínica, producida por cepas de baja virulencia, cursa con síntomas poco aparentes o muy leves acompañados de fatiga, en general se resuelven sin ningún tratamiento.

Tratamiento.- Brucella en una bacteria intracelular facultativa, por lo que se recomienda seleccionar aquellos antibióticos, que tengan la propiedad de penetrar dentro de las células blanco y que la dosis y duración del tratamiento sean las mas adecuadas. De acuerdo a la Organización de la Salud se debe establecer un tratamiento con doxicilina 200 mg/día mas rifampicina 600/900 mg/día por un periodo de seis semanas para lograr la eliminación de Brucella. La Norma Oficial Mexicana 022, recomienda: tetraciclina 2g/día mas estreptomicina 1g/24hs por 21 días. Un segundo esquema es rifampicina 600mg/dia y trimetoprim 320mg con sulfametoxazol 1600mg/día, durante 6 semanas. En caso de brucelosis ósea el tratamiento debe prolongarse por 6-8-meses. Otros tratamientos incluyen quinolonas combinadas con rifampicina o trimetoprim-sulfametoxazol.

Diagnóstico de la brucelosis humana

El diagnóstico de la brucelosis en el humano debe de considerar además de los aspectos clínicos, otros elementos que van a ser de utilidad, debido a la gran variedad de manifestaciones que esta enfermedad presenta. Por tal motivo, es muy recomendable practicar un estudio bacteriológico, complementado con la búsqueda de anticuerpos en el suero. Así como, contar con una historia clínica detallada que incluya alguna información de tipo epidemiológico.

El cultivo de la bacteria es la única evidencia contundente de que se trata de una infección por Brucella. Aunque se puede aislar de varias fuentes, la sangre es el material que se emplea con mayor frecuencia para realizar el cultivo bacteriológico. Existen algunas recomendaciones que deben de tomarse en cuenta para lograr el cultivo con éxito, en primer lugar el paciente no debe encontrarse bajo terapia antibiótica al momento de tomar la muestra y de preferencia se debe de practicar durante la fase aguda de la enfermedad, por la tarde, antes de que se alcance el pico febril. Una vez que se tenga el crecimiento de colonias sospechosas, se recomienda realizar una identificación presuntiva (ver métodos de aislamiento) (Fig. 16).

En la actualidad existen otros sistemas de aislamiento y se cuenta también con métodos moleculares como el de PCR, que es otra forma para poner de manifiesto a Brucella spp en sangre, líquido cefalorraquídeo (LCR) y otras muestras. La ventaja que presenta es su rapidez, sensibilidad y especificidad, además que permite identificar el ADN libre y procedente de bacterias muertas o dañadas por el sistema inmune o los antibióticos, que son incapaces de crecer.

Antígenos e inmunoglobulinas de importancia en el diagnóstico.- Los antígenos de mayor utilidad en el diagnóstico de la brucelosis son: el lipopolisacárido liso (S-LPS) que se encuentra en la membrana externa y las proteínas del citosol, que son internas.

El método diagnóstico mas antiguo y aún empleado es la aglutinación, para el cual se emplean suspensiones de células de B. abortus cepa 1119-3 o 99S, en fase lisa, que son las cepas recomendadas por los organismos internacionales de referencia, para la elaboración de antígenos, tanto para uso humano como para animales (Fig. 17).

Entre los métodos que emplean células completas como antígeno se puede mencionar:

· La prueba de Rosa de Bengala* (RB).- La suspensión celular se tiñe con el colorante Rosa de Bengala y se estandariza a una concentración celular del 9 -10% (para humanos). Es una prueba de escrutinio, rápida y sensible, cualquier resultado positivo deberá ser confirmado con el cultivo o en su defecto, con las pruebas serológicas complementarias que determinen el tipo de anticuerpo presente así como el título. Determina anticuerpos de las clases IgM, IgG e IgA aglutinantes en pacientes con brucelosis aguda y crónica, pero no cuantifica los anticuerpos. Permanece positiva, aún después del tratamiento y la recuperación del enfermo, en algunos casos hasta por años, por lo que en forma aislada, no es de valor diagnóstico.

· Prueba de aglutinación estándar * (SAT) Algunos autores consideran que es la prueba mas confiable por su simpleza y porque presenta un alto grado de correlación con RB, permite determinar la cantidad de aglutininas totales (IgM, IgG e IgA) anti-brucella en suero, líquido cefalorraquídeo y otros fluidos, sobre todo si se emplea el micrométodo, que solo requiere de 10 ul de muestra. No existe un consenso general en cuanto al título que indique una infección activa, por lo que, según la experiencia previa, debe de establecerse para el país. En México la norma señala un título igual o > 1/160 junto con una prueba RB positiva, para considerarse de valor diagnóstico.

· Prueba de aglutinación con 2-mercaptoetanol * (2-ME).- Es una variante de la anterior, que emplea un agente reductor para inactivar los anticuerpos IgM presentes en el suero u otros fluidos, el tratamiento permite poner de manifiesto solo aglutininas de los isotipos IgG e IgA. Títulos > 1/ 20 se consideran indicativos de brucelosis. Es una prueba que correlaciona bien con la evolución clínica de la enfermedad, de tal modo que, una vez concluida la terapia y en ausencia de síntomas se esperaría que se torne negativa. En cambio, los pacientes con recaídas presentan incremento en el título, por lo que se considera un marcador de brucelosis activa. En la brucelosis crónica su utilidad es mas limitada, por el tipo de anticuerpos que se inducen.

· Prueba de Coombs indirecto.- Se empleaba para detectar anticuerpos no aglutinantes de los isotipos IgG e IgA, sobre todo en los casos de brucelosis crónica, en los que la prueba de SAT arrojaba títulos muy bajos. En la actualidad ha sido sustituida por el método de ELISA, que brinda mayores ventajas.

· Prueba de inmunoensayo enzimático (ELISA).- Algunos autores han empleado el mismo antígeno de la prueba de SAT u otro semejante preparado con B. melitensis, para detectar los isotipos de anticuerpos característicos de una brucelosis aguda y crónica. Se ha encontrado una buena correlación entre ELISA-IgM y SAT y en menor grado entre ELISA-IgG y 2-ME, debido a que el 2ME detecta tanto aglutininas IgG como IgA .

Pruebas recomendadas en la Norma Mexicana de Control y Prevención de la Brucelosis Humana.

La respuesta inmune inducida por Brucella en el hombre, se caracteriza por una producción inicial de anticuerpos del isotipo IgM, seguida de la secreción de anticuerpos del isotipo IgG e IgA sérica. La evolución de las inmunoglobulinas se puede medir empleando ELISA-IgM (con células enteras o LPS) o la prueba de aglutinación estandar, ya que se ha observado entre ellas una buena correlación. Igual se puede evaluar IgG, empleando la prueba de aglutinación con 2-ME o ELISA para IgG, entre estas dos pruebas no existe correlación. La diferencia se debe en gran medida a que la prueba ELISA IgG, cuantifica anticuerpos no aglutinantes, que no son cuantificados por la prueba del 2-ME, por lo tanto los títulos obtenidos con ELISA-G son de mayor magnitud, que los obtenidos en la prueba de 2-ME. Esto en parte se debe, al antígeno empleado para cada prueba, usualmente para ELISA IgG, se emplea LPS crudo o purificado, cadena O, extractos proteicos o proteína purificada (Fig. 18).

Una vez concluida la antibioterapia, el título de IgM disminuye mas rápido que el de anticuerpos IgG, sin embargo, un porcentaje importante de individuos (alrededor del 40 %) que cursaron una brucelosis aguda, y fueron dados de alta clínica, continúan presentando anticuerpos IgM, meses después de la terapia. Los pacientes que sufren recaídas o infecciones recurrentes, en forma característica, presentan un incremento de anticuerpos IgG, medidos por ELISA o por la prueba de 2-ME.

Es de gran ayuda realizar una correlación entre el isotipo y el título de los distintos anticuerpos anti- Brucella con el curso clínico que siga la infección.

Existen casos en los que no se observa una disminución en el título de anticuerpos IgG, una vez concluido el tratamiento. Por lo que se recomienda realizar una evaluación del paciente, en la que se incluyan estudios serológicos y bacteriológicos, ya que el paciente, puede presentar una recaída debida a la focalización de la bacteria en algún órgano. Esta situación puede desencadenar una brucelosis crónica.

Algunos pacientes, además desarrollan anticuerpos del isotipo IgA sérico e IgE, cuya función aún es desconocida, hasta ahora se les ha relacionado con algunos episodios alérgicos o de dermatitis por brucela.

El diagnóstico serológico recomendado es aquel realizado con antígenos (RB. SAT, 2-ME, Coombs y otros ) preparados con suspensiones de Brucella abortus cepa 1119-3 o 99S en fase lisa y que hayan pasado por un proceso de control y estandarización, con lo cual, se garantizan los resultados de la prueba medidos como sensibilidad, especificidad y reproducibilidad, características que no todos los antígenos que existen en el comercio cumplen íntegramente.

El método de ELISA a pesar de ser una prueba de gran utilidad para evaluar la evolución del paciente, tiene el inconveniente del costo y del antígeno, ya que cada laboratorio usa uno diferente y a la fecha no existe ningún consenso en cuanto a que antígeno es el más adecuado para ELISA, en consecuencia, no se pueden comparar los resultados obtenidos en un laboratorio con los de otro.

La brucelosis a escala mundial y del país, continúa generando grandes pérdidas económicas tanto en la industria pecuaria como en la salud pública, por lo que aunado a las campañas de vacunación en los animales, se deben de establecer o incrementar medidas de prevención, de higiene personal y medidas sanitarias en la elaboración de los quesos y otros derivados lácteos, orientadas a evitar que la población general, que es la que se encuentra en mayor riesgo, siga consumiendo productos alimenticios que representan un riesgo para su salud.








1. Alton, G. G., L. M. Jones, R. D. Angus, & J. M. Verger, 1988. Techniques for the brucellosis laboratory. Institut National de la Recherche Agronomique, Paris.
2. Allardet-Servent, A., G. Bourg, M. Ramuz, M. Pages, M. Bellis, & G. Roizes 1988.DNA polymophism in the strains of the genus Brucella. J. Bacteriol., 170: 4603-4607
3. Araj, G. F. 1988. Profiles of Brucella-specific immunoglobulin G subclasses in sera of patients with acute and chronic brucellosis. Serodiag. Immuntherap. Infect. Dis. 2: 401-410.
4. Ariza, J., T. Pellicer, R. Pallarés, A. Foz, and F. Gudiol. 1990. Specific antibody profile in human Brucellosis. Clin. Infect. Dis. 14: 131-140.
5. Baldi, P., E. M. Silva, C.A. Fossati, & J. C. Wallach. 1996. Serological follow-up of human Brucellosis by measuring IgG antibodies to lipopolycaccharide and cytoplasmic proteins of Brucella. Clin. Infect. Dis. 22: 001-010.
6. Banai M., I. Mayer & A. Cohen. 1990. Isolation, identification and characterization in Israel of Brucella melitensis biovar 1 atypical strains susceptible to dyes and penicillin, indication of the evolution of a new variant. J. Clin. Microbiol., 28:1057-1069
7. Bricker, B. J. & S. M. Halling, 1994. Diferentiation of Brucella abortus bv. 1, 2, and 4, Brucella melitensis, Brucella ovis, and Brucella suis bv. 1 by PCR. J. Clin. Microbiol., 32: 2660-2666
8. Cloeckaert, A., J. M. Verger, M. Grayon & O. Grépinet. 1995. Restriction site polymorphism of the genes encoding the major 25 kDa and 36 kDa outer-membrane proteins of Brucella. Microbiology, 141: 2111- 2121
9. Cloeckaert, A., J. M. Verger, M. Grayon, & O. Grépinet. 1996. Polymorphism at the dnaK locus of Brucella species and identification of a Brucella melitensis species-specific marquer. J. Med. Microbiol. 45: 200-205
10. Cloeckaert, A., J. M. Verger, M. Grayon, & N. Vizcaino. 1996. Molecular and immunological characterization of the major outer membrane proteins of Brucella. FEMS Microbiol. Lett. 145: 1-8
11. Cloeckaert, A., A. Tibor, & M. S. Zygmunt. 1999. Brucella outer membrane lipoproteins share antigenic determinants with bacteria of the family Rhizobiaceae. Clin. Diagn. Lab. Immunol., 6: 627-629
12. Corbel M. J. & W. Brinley-Morgan. J.1984. Genus Brucella Meyer and Shaw 1920, 173 AL. In: Holt JG, editor. Bergey´s manual of systematic bacteriology vol. 1. Baltimore (MD) Williams and Wilkins, 377-388
13. Corbel, M. J. Microbiology of the genus Brucella. En: Young EJ, Corbel MH, editors. Brucellosis; clinical and laboratory aspects. Boca Ratón. CRC Press Inc., 1989, pag. 54-72
14. Fekete, A., J. A. Bantle, S. M. Halling. & R. W. Stich. 1992. Amplification fragment length polimorphism in Brucella strains by use of polymerase chain reaction with arbitrary primers, J. Bacteriol., 174: 7778-7783
15. Ficht, T. A., S. W. Bearden, B. A. Sowa. & H. Marquis. 1990. Genetic variation at the omp2 porin locus of the Brucellae species-specific markers. Mol. Microbiol., 4: 1135-1142
16. Ficht, T. A., H. S. Husseinen, J. Derr, & S. W. Bearden. 1996. Species-specific sequences at the omp2 locus of Brucella type strains. Int. J. Syst. Bacteriol., 46: 329-331
17. Fretin, D., A. Fauconnier, S. Halling, S. Köhler, P. Lestrate, A. Dricot, S. Genevrois, A. Tibor, J. Vandenhaute, & J. J. Letesson. Involvement of flagelar genes in Brucella virulence. En: Brucellosis 2000, and 53rd Brucellosis Research Conference, Abstract 107, pag. 98
18. Forestier, C., E. Moreno, S. Mérese, A. Phalipon, D. Olive, P. Sansonetti, & J. P. Gorvel. 1999. Interaction of Brucella abortus lipopolysaccharide with major histocompatibility complex class II molecules in B-lymphocytes. Infect. Immun., 67: 4048-4054
19. Grimont, F., J. M. Verger, P. Cornelis, J. Limet, M. Lefévre, M. Grayon, B. Régnault, J. Van Broeck, & P. D. A. Grimont. 1992. Molecular typing of Brucella with cloned DNA probes. Res. Microbiol., 143: 55-65
20. Halling, S. M. & E. S. Zehr. 1990. Polymorphism in Brucella spp, due to highly repeated DNA. J. Bacteriol., 172: 6637-6640
21. Huerta-Peña M. & A. López-Merino. 1989. Clasificación de las cepas de Brucella pertenecientes a la colección del Laboratorio de Brucelosis del INDRE. Rev Lat-amer Microbiol 31: 195 - 198
22. Jahans, K., G. Foster, & E. S. Broughton.1997. The characterization of Brucella strains isolated from marine mammals. Vet. Microbiol., 57: 373-382
23. Joint FAO/WHO 1986.Expert Committee on Brucellosis. Six Report. World Health Organ Tech Rep Ser No 740. Geneva: World Health Organization
24. Leal-Klevezas, D. S., I. O. Martínez-Vázquez, A. López-Merino, & J. P.Martínez -Soriano. 1995. Single-step PCR for detection of Brucella spp. from blood and milk of infected animals. J. Clin. Microbiol., 33: 3087-3090
25. LeVier, K., R. W. V. K. Phillips, R. M. Grippe, R. M. Roop II & G. C. Walter. 2000. Similar requirements of a plant symbiont and a mammalian pathogen for prolonged intracellular survival. Science, 287: 2492-2493
26. López-Merino A. Brucellosis in Latin America. Young EJ, Corbel MH, editors. Brucellosis: clinical and laboratory aspects. Boca Ratón. CRC Press Inc., 1989, pag. 151-161
27. Mercier, E., E. Jumas-Bilak, A. Allardet- Servent, D. O'Callaghan, & M. Ramus. 1996. Polymorphism in Brucella strains detected by studying distribution of two short repetitive DNA elements. J. Clin Microbiol., 34: 1299-1302
28. Michaux-Charachon, S., G. Bourg, E. Jumas-Bilak, P. Guigue-Talet, A. Allardet-Servent, D. O'Callaghan & M. Ramus. 1997 Genome structure and phylogeny in the genus Brucella. J. Bacteriol., 179: 3244-3249
29. Moreno, E., E. Stackebrandt, M. Dorsch, J. Wolters, M. Busch & H. Mayer. 1990. Brucella abortus 16S rRNA and lipid A reveal a phylogenetic relationship with members of the alpha-2 subdivision of the class Proteobacteria. J. Bacteriol., 172: 3569-3576
30. Nicoletti, P. L. Relationship between animal and human disease. En: Young EJ, Corbel MH, editors. Brucellosis; clinical and laboratory aspects. Boca Ratón. CRC Press Inc., Young EJ, Corbel MH, editors. Brucellosis; clinical and laboratory aspects. Boca Ratón. CRC Press Inc., 1989, pag. 42-51
31. Norma Oficial Mexicana. NOM-022-SSA2-1994. Para la prevención y control de la brucelosis en el hombre, en el primer nivel de atención. Publicada en el Diario Oficial de la Federación el día 30 de noviembre de 1995.
32. O'Callaghan, D., C. Cazevieille, A. Allardet-Servent, M. L. Boschiroli, G. Bourg, V. Foulogne, P. Frutos, Y. Kulakov & M. Ramus. 1999. A homologue of the Agrobacterium tumefaciens VirB and Bordetella pertusis Ptl typeIV secretion systems is esential for intracellular survival of Brucella suis. Mol. Microbiol., 33: 1210-1220
33. Ouahrani, S., S. Michaux, J. S. Widada, G. Bourg, R. Tournebize, M. Ramus. & Liautard, J. P. 1993. Identification and sequence analysis of IS6501, an insertion sequence in Brucella spp: relationship between genomic structure and the number of IS6501 copies. J. Gen Microbiol., 139: 3265-3273
34. Ouahrani-Bettache, S., M. P. Soubrier, & J. P. Liautard. 1996. IS6501-anchored PCR for the detection and identification of Brucella species and strains. J. Appl. Bacteriol., 81: 154-160
35. Pizarro-Cerdá, J., S. Méresse, G. R. Parton, G. Van der Goot, A. Sola-Landa, I. López-Goñi, E. Moreno, & J. P. Gorvel. 1998. Brucella abortus transits throug the autophagic pathway and replicates in the endoplasmic reticulum of non professional phagocytes. Infect. Immun., 66: 5711-5724
36. Porte, F., J. P. Liutard, & S. Köhler. 1999. Early acidification of phagosomes containing Brucella suis is essential for intracellular survival in murine macrophages. Infect. Immun., 67: 4041-4047
37. Robertson, G. T. & R. M. Roop II. 1999. The Brucella abortus host factor I (HF-I) protein contributes to stress resistance during stationary phase and is a major determinant of virulence in mice. Mol. Microbiol. 34: 690-700
38. Rodríguez, M. C., A. Froger, C. Delamarche, J. Agüero, D. Thomas, & J. M. García-Lobo. Molecular cloning and characteriztion of AqpX a water channel from Brucella abortus. En: Brucellosis 2000, and 53rd Brucellosis Research Conference, Abstract 101, pag. 94
39. Sieira, R., D. J. Comerci, D. O. Sánchez & R. A. Ugalde. 2000. A homologue of an operon required for DNA transfer in Agrobacterium is required in Brucella aabortus for virulence and intracellular multiplication. J. Bacteriol., 182: 4849-4855
40. Sola-Landa A., J. Pizarro-Cerdá, M. J. Grilló, E. Moreno, I. Moriyon, J. M. Blasco, J. P. Gorvel & I. López Goñi. 1998. A two-component regulatory system playing a critical role in plant pathogens and endosymbionts is present in Brucella abortus and controls cell invation and virulence. Mol. Microbiol. 29: 125-138
41. Teixeira-Gomez, A. P., A. Cloeckaert, & M. S. Zygmunt. Characterization of heat, oxidative, and acid stress responses in Brucella melitensis. Infect. Immun., 68: 2954-2961
42. Velazco, J., R. Díaz, M.J. Grilló, M. Barberán, C. Marín, J. M. Blasco, I. Moriyón. 1997. Antibody and delayed-type hypersensitivity responses to Ochrobactrum anthropi cytosolic and outer membrane antigens in infection by smooth and rough Brucella spp. Clin. Diagn. Lab. Immunol., 4: 279-284
43. Verger, J. M., F. Grimont, P. D. A. Grimont, & M. Grayon. 1985. Brucella a monospecific genus as shown by deoxyribonucleic acid hybridization. Int. J. Syst. Bacteriol., 35: 292-295
44. Verger, J. M., M. Grayon, A. Tibor, V. Wansard, J. J. Letesson, & A. Cloeckaert, 1998. Res. Microbiol., 149: 509-517
45. Vizcaino, N., J. M. Verger, M. Grayon, M. S. Zygmunt, & A. Cloeckaert. 1997. DNA polymorphism at the omp-31 locus of Brucella spp.: evidence for a large deletion in Brucella abortus, and other species-specific markers. Microbiology, 143: 2913-2921
46. Young, E. J. 1990. Serologic diagnosis of human brucellosis: Analysis of 214 cases by agglutination tests and review of the literature. Rev. Infect. Dis.13:359-372.





[ Regresar ]