Guadalupe Espín

Instituto de Biotecnología, Universidad Nacional Autonoma de México

Generalidades del género Azotobacter

La familia Azotobacteriaceae comprende a las bacterias del género Azotobacter, las cuales son Eubacterias Gram-negativas que tienen una pared celular compleja que consiste de una membrana externa y una capa interna de peptidoglicano que contiene ácido murámico y mureína. Se reproducen por fisión binaria, viven en suelos y en aguas frescas, son células ovoides y grandes de 1.5 a 2.0 μm de diámetro. Son pleomórficas, variando su morfología desde bacilos hasta células en forma de cocos. Se les observa como células individuales, como pares o formando agregados irregulares, y algunas veces formando cadenas de tamaño variable. Algunas especies como A. vinelandii y A. chrocoocum sufren un proceso de diferenciación para formar quistes resistentes a la desecación. Se mueven por flagelos perítricos, son aerobios, pero pueden crecer en concentraciones de oxígeno bajas. Algunas cepas producen pigmentos solubles o insolubles en agua.

Son quimioorganotróficas, utilizan azúcares, alcoholes y sales inorgánicas para crecer. Son fijadores de nitrógeno; en vida libre fijan al menos 10 mg de N₂ por gramo de carbohidrato (glucosa) consumido. Requieren molibdeno para fijar nitrógeno que puede ser parcialmente reemplazado por vanadio. Utilizan nitrato y sales de amonio y ciertos aminoácidos como fuentes de nitrógeno. Son catalasa positivos. El rango de pH en el que crecen en presencia de nitrógeno combinado es 4.8-8.5 el pH óptimo para crecer cuando fijan nitrógeno es 7.0-7.5.

Azotobacter vinelandii es una bacteria poliploide, es decir posee varias copias de su cromosoma, se calcula que pueden tener hasta 80 copias. El número de copias varía dependiendo del medio y las condiciones de cultivo así como de la fase de crecimiento (35). Es de tamaño muy grande de 2x5 nm de diámetro es decir de 5 a10 veces el volumen de E. coli. Se ha asociado el tamaño con la poliploidía (Fig. 1).

Las capacidades metabólicas y genéticas por las que A. vinelandii ha sido y es objeto de estudio son principalmente:

1. Fija nitrógeno en presencia de oxígeno por tres sistemas diferentes de nitrogenasa.

2. Posee mecanismos de protección de la nitrogenasa

3. Posee una alta capacidad respiratoria que en condiciones diazotróficas o de fijación de nitrógeno es hasta 10 veces más alta que la de Escherichia coli.

4. Produce dos polímeros de uso industrial: el polisacárido extracelular alginato y el poliéster intracelular polihídroxibutirato.

5. Sufre un proceso de diferenciación morfológica para formar quistes resistentes a la desecación.

Fijación de nitrógeno

La fijación biológica de nitrógeno o reducción de N₂ a NH₄, es un proceso que pueden llevar a cabo solo algunos procariotes gracias a que poseen el complejo enzimático conocido como nitrogenasa, la cual está formada por dos proteínas: una proteína que contiene fierro (proteína-Fe) y otra que contiene molibdeno y fierro (proteína Mo-Fe). La nitrogenasa que contiene molibdeno Mo es la más ampliamente distribuida.

Las bacterias fijadoras de nitrógeno o diazótrofas, ocupan un nicho ecológico indispensable ya que suplen de nitrógeno fijado al ciclo global del nitrógeno. Gracias a este papel los diazótrofos están presentes en virtualmente todos los ecosistemas, con representantes en ambientes tan variados como la superficie de los océanos (Tricodesmiun), los nódulos de las raíces de las plantas (Rhizobium), y en suelos aeróbicos como es el caso de Azotobacter.

En cualquier ecosistema los diazótrofos responden a condiciones variadas del ambiente para regular el muy caro proceso de fijación de nitrógeno. Todos los diazótrofos regulan la nitrogenasa a nivel transcripcional. Algunos también poseen sistemas rápidos de regulación postranscripcional.

La fijación de nitrógeno ó reducción de N₂ a NH₄ requiere 8 electrones, por lo tanto se requiere un mínimo de 16 ATP para reducir una molécula de N₂ atmosférico. Además la reducción de N₂ está siempre acoplada a la reducción de H⁺ a H₂. Bajo condiciones fisiológicas normales el requerimiento de ATP es de 20 a 30 moléculas de MgATP, en consecuencia la fijación de nitrógeno puede consumir una fracción significativa de la poza celular de ATP. El ATP utilizado en la fijación de nitrógeno lo provee la respiración aeróbica. Por lo tanto la fijación de nitrógeno aeróbica requiere una concentración de O₂ mínima.

La nitrogenasa un complejo enzimático sensible al oxígeno

La nitrogenasa purificada es inactivada rápida e irreversiblemente por el O₂ (15). La proteína Fe es mucho más sensible que la proteína MoFe con una vida media en presencia de aire de 45 segundos y 10 minutos respectivamente (55). El efecto de O₂ sobre la nitrogenasa restringe la fijación de N₂ en la mayoría de las especies de eubacterias a condiciones anaeróbicas o de microaerobiosis.

La fijación de nitrógeno en bacterias aeróbicas como Azotobacter es un proceso que demanda gran cantidad de energía, por lo que requiere una eficiente fosforilación oxidativa. Debido a que el O₂ es tóxico para el complejo de la nitrogenasa, las bacterias aeróbicas fijadoras de nitrógeno han evolucionado una variedad de estrategias para contender con esta paradoja aparente.

A. vinelandii fija nitrógeno en aerobiosis

A. vinelandii era hasta hace poco la única bacteria reconocida capaz de fijar nitrógeno en condiciones de total aerobiosis (45), recientemente se describió otro sistema de fijación de nitrógeno tolerante a O₂ en Streptomyces thermoaututrophicus (54). Azotobacter fija nitrógeno en aerobiosis gracias a que posee un sistema bien integrado de protección de su nitrogenasa que comprende: protección conformacional, protección respiratoria, autoprotección y otros cambios morfológicos y fisiológicos que le permiten crecer diazotróficamente en condiciones totalmente aeróbicas (26).

Protección conformacional. En A. vinelandii un aumento pasajero del O₂ provoca un mecanismo de inactivación (switching-off) de la nitrogenasa, que consiste en la formación de un complejo de nitrogenasa inactivado pero protegido, conocido como protección conformacional. Este complejo es formado por la unión no covalente de una proteína que contiene Fe-S (conocida como FeSII o Shetna) a las proteínas Fe y MoFe (33, 34)

Protección respiratoria. Cuando las células se adaptan al ambiente de mayor concentración de O₂, se expresa la citocromo oxidasa cytbd, parcialmente desacoplada con baja afinidad por O₂, la cual probablementa actúa junto con una NADH deshidrogenasa desacoplada. El flujo de electrones a través de esta cadena desacoplada permite tasas de respiración altas y un rápido consumo del O₂ intracelular sin agotar las pozas de ATP y NADH. La tasa respiratoria en condiciones de fijación de nitrógeno atmosférico es 10 veces más alta que la tasa normal de muchas bacterias. Además de reducir el O₂ la citocromo oxidasa cytbd, funcionaría como un productor de ATP rápido ya que se necesitan grandes cantidades de ATP para la autoprotección de la nitrogenasa.

Autoprotección. Si la concentración de nitrogenasa es lo suficientemente alta en relación a la concentración de O₂ celular, la nitrogenasa reductasa puede reducir O₂ a H₂O₂ y posiblemente a H₂O y por lo tanto reduciría el O₂ en la vecindad de la nitrogenasa. Además el flujo constante de equivalentes reductores a través de la nitrogenasa puede ayudar a mantenerla en un estado reducido (66). Este proceso conocido como autoprotección requiere grandes cantidades de equivalentes reductores y ATP que son los provistos por la rama cytab de la cadena respiratoria.

Es todavía motivo de controversia si la alta tasa respiratoria reduce la concentración intracelular de O₂ (protección respiratoria) o solo funciona para proveer equivalentes reductores y ATP a la nitrogenasa consumidora de O₂ (autoprotección). Sin embargo se ha comprobado que las altas tasas respiratorias son esenciales para la fijación de nitrógeno tolerante a O₂ en Azotobacter vinelandii. Mutantes en la oxidasa terminal cytab son incapaces de fijar nitrógeno aeróbicamente.

Nitrogenasas alternativas

Además de la extensivamente caracterizada nitogenasa que requiere molibdeno, Azotobacter vinelandi posee otras dos nitrogenasas alternativas: una que contienen vanadio y otra que contiene Fe.

De su capacidad de producir polímeros.

Alginato.

Otra de las características por las que Azotobacter vinelandii, ha sido objeto de estudios es su capacidad para producir el polisacárido extracelular alginato. Este polisacárido es utilizado como agente gelificante y viscosificante en industrias como la farmacéutica y la alimenticia.

Aplicaciones del alginato

Los alginatos son utilizados principalmente como aditivos para gelificar, emulsionar, estabilizar o viscosificar soluciones acuosas, también en el recubrimiento y protección de heridas (curitas) y en la inmovilización de células y enzimas (14). En la actualidad los alginatos utilizados en la industria, son extraídos de algas marinas cafés de los géneros Laminaria, Macrocystis y Ascophyllum. La composición de los alginatos algales esta sujeta a las variaciones del medio ambiente y a la edad de las tejidos de donde son extraídos por lo cual la calidad de estos alginatos es también muy variable. Es por esta razón que la producción de alginatos de origen bacteriano con calidad uniforme representa una alternativa interesante.

Composición y estructura de alginato

Los alginatos son una familia de heteropolímeros lineales compuestos por monómeros de ácido manurónico (M) y su epímero el ácido gulurónoico (G) los cuales están unidos por enlaces β(1-4) Fig. 2. La distribución y contenido de los monómeros puede ser muy variada y va desde cadenas con secuencia alternas MGMGMG, bloques MMMGGGMMM, en las que el número de monómeros en los bloques es también muy variable (21). En presencia de Ca u otros iones divalentes, los alginatos forman geles termo-irreversibles. La variabilidad en la composición de los monómeros del alginato le confiere también variabilidad en la capacidad de gelificación: un alginato con alto contenido de ácido gulurónico genera geles rígidos, mientras que uno de bajo contenido produce geles suaves y elásticos (7).

Función biológica del alginato

El alginato es esencial para el enquistamiento ya que es un componente esencial de las dos capas que cubren a los quistes maduros llamadas exina e intina de las cuales el 32 y 13% de su peso seco es alginato (41). Las mutantes no productoras de alginato son incapaces de formar quistes maduros (4, 30). En la Fig. 3 se muestran fotografías al microscopio electrónico de cultivos de A. vinelandii (en condiciones donde se induce el proceso de enquistamiento) de una cepa productora de alginato Fig. 3a y una mutante no productora de alginato Fig. 3b. En la primera se observa el alginato formado parte de la cápsula de los quistes. El alginato también es producido en células vegetativas no diferenciadas, en estas condiciones la función del alginato pudiera ser la formación de películas que le permiten a la bacteria adherirse a superficies (7, 9). La acumulación extracelular del alginato pudiera también actuar como una barrera contra la difusión de oxigeno o metales pesados (7, 13) o de protección contra otro tipo de ofensas del medio ambiente.

Bioquímica de la síntesis de alginato

En A. vinelandii el alginato se sintetiza a partir de fructosa-6-P, la cual es convertida por la fosfo-manosa-isomerasa (PMI), a manosa-6-P, esta a su vez se convierte en manosa-1-P por la fosfo-mano-mutasa (PMM). El siguiente paso consiste en la activación de la manosa-1-P por la GDP-manosa-pirofofofrilasa (GPMP) dando como resultado la formación de GDP-manosa, la cual es oxidada a ácido GDP-manurónico por la GDP-manosa-deshidrogenasa (GMD). El ácido GDP-manurónico es el substrato que se polimeriza a nivel de la membrana interna para formar ácido polimanurónico. En el periplasma algunos de los residuos manurónicos del ácido polimanurónico son acetilados por una acetilasa (42). El polímero es exportado fuera de la célula donde algunos residuos manurónicos no acetilados son epimerizados a residuos gulurónicos por múltiples epimerasas extracelulares dando así el producto final el alginato (12). Fig. 4

Los genes de la biosíntesis de alginato

Los genes que codifican para las enzimas que participan en la síntesis, excreción y modificación del alginato han sido identificados en A. vinelandii. Excepto algC que codifica para la (PMM), todos los genes estructurales se encuentran agrupados en el cromosoma y se transcriben a parir de varios promotores. Fig. 5 El gen algD, que codifica la GDP-manosa deshidrogenasa (GMD), se transcribe a partir de tres promotores (4, 38). Los genes alg8, alg44, algK y algJ que se localizan inmediatamente abajo de algD están organizados en una unidad transcripcional (29) y sus productos participan en la polimerización y secreción del alginato: el producto de alg8 es una glicosil transferasa membranal que se ha propuesto con actividad de polimerasa; alg44 codifica otra proteína de membrana interna, la cual se propone forma parte del un complejo de polimerización o que tiene que ver con el transporte del polímero al periplasma (29), algJ codifica para una proteína de membrana externa con actividad de canal iónico que es esencial para la secreción del alginato (48) y el producto de algK es una proteína periplásmica que pudiera participar en la incorporación de AlgJ en la membrana externa (29). Inmediatamente después de este operón se encuentra el operón algGXLVIFA (67). algG codifica para una epimerasa (47), algL para una alginato liasa o alginasa (23). Los productos de algX, algV, algI y algF son los responsables de la acetilación de los residuos manurónicos en el periplasma (67) y el producto de algA es la enzima bifuncional que cataliza el primer y tercer pasos de la vía (23, 67).

Control genético

La expresión o transcripción de los genes estructurales de la vía de síntesis del alginato está bajo el control de una serie de proteínas reguladoras que incluyen factores sigma alternativos y sus reguladores negativos o antisigmas, así como la participación de proteínas reguladoras de la familia de dos componentes.

Factores sigma σ alternativos y sus antisigmas

Un promotor procariote es la secuencia de ADN donde la ARN polimerasa inicia la transcripción, el reconocimiento de esta secuencia lo lleva a cabo una proteína del complejo de la ARN polimerasa conocido como el factor sigma σ. E. coli por ejemplo, contiene seis diferentes factores sigma, cada uno de los cuales reconoce diferentes secuencias promotoras, el más estudiado es el factor σ⁷⁰ que se requiere para la transcripción de los genes involucrados en las funciones fundamentales de la célula durante el crecimiento exponencial. Los otros factores sigma regulan la transcripción de genes involucrados en otras funciones son: σ³² que participa en la respuesta al shock de calor, σ²⁴, en la asimilación de nitrógeno, σ²⁸ en la síntesis del flagelo, y sigma σ³⁸ en la expresión de genes de fase estacionaria. A su vez la actividad de algunos de estos factores sigma es controlada de manera negativa por proteínas conocidas como factores anti-sigma, estos factores anti-sigma en algunos casos se unen al factor sigma y previenen así su unión a los promotores (49).

En A. vinelandii se identificó y caracterizó el operón algUmucABCD cuyos productos participan en el control de la síntesis de alginatos (27). El gen algU codifica para un homólogo del factor sigma alternativo σ^E o σ³² presente en otras bacterias Gram-negativas en donde reconoce promotores de genes cuyos productos participan en la respuesta de la células a daños del medio ambiente en las que se incluye principalmente altas temperaturas y a agentes superoxidantes. Cepas de A. vinelandii con mutaciones en algU no producen alginato y abaten la transcripción del gen algD a partir de uno de sus tres promotores p2 ( 27, 31). Los productos de mucA y mucB controlan de manera negativa la actividad de AlgU o σ^E actuando a manera de antisigmas (27, 31). Mutaciones en estos genes aumentan de manera considerable la producción de alginato así como la transcripción del gene algD (40). En la Fig. 6 se presenta un esquema de la regulación de la transcripción del gene algD por los productos del operón algUmucABCD.

Sistemas reguladores de la familia de dos componentes

Muchas especies de bacterias responden a señales o cambios de su medio ambiente a través de activar la transcripción de genes cuyos productos ayudan a la bacteria a contender con el nuevo ambiente. Los sistemas de transducción de señales de dos componentes constituyen el principal mecanismo mediante el cual las bacterias contienden y responden a estos cambios (19). Estos sistemas están formados como su nombre lo indica por dos proteínas (Fig 7): una que detecta las señales del medio ambiente, y la segunda que en la mayoría de los casos es un regulador transcripcional, cuya actividad es controlada por la primera.

El primer componente de este sistema es una proteína con actividad de histidina cinasa, con algunas excepciones la parte amino terminal de estas proteínas contiene dos dominios transmembranales, los cuales flanquean a una porción de la proteina que se sitúa en el periplasma, a esta región se le ha involucrado en la detección de señales ambientales y se le conoce como dominio de entrada. La región citoplásmica de estas cinasas contiene varios motivos conservados que tienen un papel en la actividad de fosforlilación entre estos se encuentra un motivo que contiene una histidina H, que es el residuo que se fosforila en este tipo de proteínas. A estos motivos en su conjunto se les conoce como el módulo transmisor.

El segundo componente (Fig 7) es la proteína que se conoce como regulador de respuesta y está constituida generalmente por dos dominios: el dominio de fosforilación que se encuentra en el extremo amino terminal contiene un residuo de ácido aspártico que es el que se fosforila, a este dominio se le conoce como modulo receptor. El segundo dominio es generalmente de unión a ADN y se conoce como dominio de salida.

Mecanismo de transducción de señales de los sistemas de dos componentes

Basado en estudios hechos en los sistemas de dos componentes NtrC-NtrB y EnvZ-OmpR de Escherichia coli se ha propuesto el siguiente mecanismo de transducción de señales por los sistemas de dos componentes (Fig. 8): Cuando una señal es detectada por el dominio periplásmico de la histidina cinasa, esta se autofosforila en el residuo de histidina del dominio transmisor utilizando ATP como donador de fosfato. Estas histidinas en condiciones fisiológicas se encuentran en forma dimérica y la fosforilación se lleva a cabo por un mecanismo transmolecular donde cada monómero fosforila a su pareja (37). El grupo fosfato se transfiere del dominio transmisor al dominio receptor del regulador de respuesta. La fosforilación del regulador de respuesta genera un cambio conformacional que le permite su unión a la región promotora de los genes que van a activar, también conocidos como genes blanco (Stock et al 1995).

Regulación de la síntesis de alginato por sistemas de dos componentes

Otros genes reguladores de la síntesis de alginato descritos recientemente son los genes gacS (5) y gacA (6) los productos de estos corresponden a una histidina cinasa trans-membranal y su regulador de respuesta y pertenecen a la familia de dos componentes. Homólogos de estos genes están presentes en muchas bacterias Gram-negativas donde actúan como reguladores globales controlando la producción de antibióticos, toxinas y metabolitos secundarios. En Pseudomonas aeruginosa también controlan el mecanismo que sensa quorum de células bacterianas a través de regular la síntesis de homoserína lactonas (8, 50). El sistema GacS-GacA está altamente conservado en bacterias Gram negativas. En A. vinelandii están presentes homólogos de gacS y gacA y la inactivación de estos genes resulta en un abatimiento de la transcripción del gen algD, y por lo tanto la producción de alginato. No se sabe si GacA activa directa o indirectamente la transcripción del gen algD, sin embargo dada la naturaleza global del sistema y de acuerdo con lo que se conoce de este sistema en otros géneros de bacterias como Pseudomonas, es muy probable que la regulación sea indirecta, es decir que participen otros intemediarios en la señalización desde gacSA hasta el promotor algD. En la Fig 9 se presenta el modelo propuesto para la regulación de la expresión del gen algD por el sistema GacS-GacA.

Otro gen de la familia de dos componentes que participa en la regulación de la síntesis de alginatos es algR el cual codifica para un regulador de respuesta o sea un activador transcripcional. Mutaciones en este gen disminuyen en un 50% la producción de alginatos (38), sin embargo se desconoce el blanco de regulación de este activador.

Señales del medio que promueven la síntesis de alginatos

Aunque en los últimos años se ha avanzado en el conocimiento de la genética de la producción de alginatos, poco se conoce de las señales del medio ambiente que esta bacteria sensa para activar sus vías de señalización para el encendido y apagado de los genes de la biosíntesis de alginato. Recientemente se encontró que mutaciones que afectan el reciclaje de la pared celular causan cambios en la morfología de la célula, (dada principalmente por la integridad de la pared celular) y aumentan la producción de alginato a través de incrementar la transcripción del gen algD a partir de sus tres promotores Fig. 10 (39). Estos resultados sugieren que daños en la pared celular son sensados por alguna vía de señalización que enciende la transcripción del gen algD y por lo tanto la síntesis del alginato. Esta vía pudiera ser la que encabeza el sistema GacSA.

Los resultados hasta ahora obtenidos nos indican que la expresión del gen algD que codifica para la enzima clave de la síntesis de alginato es un blanco muy importante en el control de la producción de alginatos y que su regulación es muy compleja: se transcribe a partir de tres promotores: p1 un promotor reconocido por el factor sigma alternativo de fase estacionaria σ³⁸ ó σ^S; p2 cuya actividad requiere del factor sigma alternativo σ³² ó σ^E o AlgU y el promotor p3 que no presenta secuencias consenso de promotores bacterianos conocidos. La transcripción de este gen esta bajo el control del sistema regulador global de dos componentes GacSA. En la Fig. 11 se presenta un modelo esquemático de la regulación de la expresión de los genes de la síntesis de alginato en A. vinelandii en el que destaca la transducción de señales mediada por el sistema regulador global de dos componentesGacS-GacA. Los modelos propuestos son generalmente modelos dinámicos que constantemente cambian y se modifican cuando surgen nuevos datos.

Polihídroxibutirato

El polihídroxibutirato (PHB) es un polímero compuesto por monómeros de β- hidroxibutirato (Fig. 12) que forma parte de la familia de los polialkanoatos (PHAs) los cuales son poliésteres formados por unidades de 3-hidroxiácidos (1) y son producidos por mas de 90 géneros bacterianos entre las que se encuentra Azotobacter. Desde el punto de vista biotecnológico son interesantes pues constituyen un grupo complejo de elastómeros y termoplásticos naturales con propiedades semejantes a las del propileno y el polietileno y tienen la ventaja de ser biodegradables (10), por lo que representan una alternativa viable para la producción de plásticos no contaminantes.

La composición monomérica de estos poliésteres determina las características físicas del polímero. La gran diversidad de PHAs permite obtener plásticos con características que van desde materiales rígidos y quebradizos, hasta productos semejantes al hule.

La utilización de estos compuestos como materia prima para la fabricación de materiales biodegradables es ya una realidad, algunos productos como el Biopol un copolimero de 3-hidoxibutirato y 3-hidroxivalerato ya se venden comercialmente.

Función biológica del PHB

Son varias las funciones que se le atribuyen al PHB, la principal es la de constituir un material de reserva de carbono y energía que puede ser utilizado en períodos de limitación de nutrientes en el medio, ya que este polímero almacena grandes cantidades de carbono reducido en forma de gránulos intracelulares insolubles, sin afectar la presión osmótica de la célula (20).

Otra de las funciones que se le atribuyen al PHB en A. vinelandii esta relacionada con la fijación biológica de nitrógeno, específicamente con la protección de la nitrogenasa ya que se propone que el PHB permite la protección respiratoria en ausencia de una fuente de carbono exógena, al proveer a la célula de una fuente de energía y carbono rápidamente oxidable, permitiendo mantener una tasa respiratoria adecuada para disminuir la concentración de oxígeno contribuyendo así a la protección de la nitrogenasa (59, 62).

Otro papel propuesto para el PHB es el de regulador de los equivalentes de reducción intracelulares. Cuando en la célula se presenta una condición de baja concentración de oxígeno, como la requerida para la fijación de nitrógeno y existe una concentración de carbono alta, se favorece la acumulación de NADH y NADPH. En A. vinelandii estos metabolitos inhiben varias enzimas del catabolismo de glucosa y del ciclo de Krebs (62), en estas condiciones se sintetiza el PHB. Se ha propuesto que la síntesis de este polímero permite regular la concentración de los reductores, ya que almacena electrones durante su síntesis previniendo la generación de una concentración alta de NAD(P)H y permitiendo el funcionamiento de vías metabólicas oxidativas, aun a concentraciones bajas de oxígeno celular (62).

Por último la síntesis de PHB esta involucrada en procesos de diferenciación celular, por ejemplo en algunas especies del género Bacillus el PHB sirve como fuente de carbono y energía para la formación de esporas (1). En A. vinelandii el metabolismo de PHB esta íntimamente relacionado con el proceso de diferenciación que da como resultado la formación de quistes resistentes a la desecación (ver mas adelante).

Via de síntesis del PHB

En A. vinelandii están presentes tres actividades enzimáticas que llevan a cabo la biosíntesis de PHB. El primer paso de la vía consiste en la condensación de dos moléculas de acetil-CoA por la enzima β- cetotiolasa para generar acetoacetil-CoA, la cual es reducida por una cetoacetil-CoA reductasa utilizando NADPH y produciendo D(-)-B-hidroxibutiril-CoA que finalmente es polimerizado por la actividad de la PHB sintasa (Fig. 13)

Regulación de la biosíntesis de PHB

En general en las bacterias productoras de PHB, se presenta la acumulación del polímero en respuesta a una limitación para su crecimiento, principalmente por la falta de algún nutrimento como nitrógeno, fósforo, magnesio u oxígeno, y en presencia de un exceso de fuente de carbono y energía (1).

Por estudios realizados en A. vinelandii y en Azotobacter beijerinkii se pensaba que el control de la síntesis de PHB se presenta principalmente a nivel post-traduccional, controlando alostéricamente las enzimas de la vía (62, 25). Un punto de control importante es la actividad de la enzima β-cetotiolasa (Fig. 13). La β- cetotiolasa es activada cuando la relación acetil-Coa/CoA es alta, situación que se puede dar cuando se acumula NADH o NADPH como respuesta a la baja concentración de oxígeno en el medio. Como estos metabolitos inhiben a las enzimas del ciclo de Krebs citrato sintasa e isocitrato deshidrogenasa, se disminuye el flujo de carbono hacia este ciclo lo que genera un incremento de la relación acetil-CoA/CoA y por lo tanto la estimulación de la actividad de β- cetotiolasa (62) Estas condiciones también favorecen la actividad de la enzima que cataliza el segundo paso de la vía, la acetoacetil-CoA reductasa.

Genes estructurales de la vía de síntesis de PHB

En A. vinelandii identificamos tres genes que codifican proteínas con una alta identidad a cetotiolasas, uno de estos genes phbA, codifica para la β- cetotiolasa especifica para la síntesis de PHB (60). En nuestro grupo hemos clonado y secuenciado los genes phbB y phbC que codifican para la segunda y tercera enzima de la vía (61) (Fig. 14) y estamos actualmente en el proceso de investigar su organización transcripcional e identificar los elementos genéticos y del medio ambiente que participan en su regulación.

Regulación de la síntesis de PHB a nivel transcripcional

Hasta recientemente se aceptaba que la síntesis de PHB en bacterias del género Azotobacter, sólo estaba regulada a nivel de controlar la actividad de la primera enzima de la vía, sin embargo trabajos en mi grupo de investigación nos han permitido obtener evidencias de la existencia de otros niveles de regulación de esta ruta biosintética a nivel transcripcional que involucran varios tipos de regulación: uno por el sistema de regulación global de la familia de dos componentes GacS- GacA, ya descrito en este capítulo y que controla también la síntesis de alginato (5, 6). Las mutantes gacS o gacA tienen una muy disminuida transcripción de los genes estructurales phb y por lo tanto una capacidad disminuida de producir PHB (5, 61). Otro gen regulador positivo de la síntesis de PHB en A. vinelandii es el gen phbR que codifica para un activador transcripcional de la familia de lysR. Las mutaciones en este gene disminuyen en un 50% la producción de PHB (61). El control de la transcripción de los genes estructurales parece también estar regulado por proteínas homólogas a las del sistema fosfotransferasa de azúcares fosfoenolpiruvato dependientes ó PTS (59).

El sistema PTS

PTS es un sistema que interviene en el transporte y fosforilación concomitante de muchos carbohidratos en numerosos géneros bacterianos (43) y esta formado por una cadena de proteínas que intervienen en una cascada de fosforilaciones (Fig. 15). La cascada inicia con la enzima I (EI), la cual se autofosforila utilizando fosfoenolpiruvato (PEP) y transfiere al grupo fosfato a la proteína Hpr. Estas dos proteínas solubles son los componentes generales del sistema. Posteriormente se transfiere el fosfato de la proteína Hpr al componente II (IIA), el cual es azúcar- específico y funciona como permeasa, fosforilando de manera concomitante al carbohidrato transportado. Además del transporte y fosforilación de azucares, el sistema PTS lleva a cabo varias funciones de regulación metabólica y transcripcional en diversas bacterias Gram-positivas y Gram-negativas. Por ejemplo, este sistema es responsable de la represión catabólica que ejerce la glucosa. Cuando la glucosa esta presente en el medio, la proteína IIAGlu se encuentra principalmente defosforilada, pues transfiere el grupo fosfato a este carbohidrato. La proteína IIAGlu defosforilada inhibe la actividad de proteínas del catabolismo de otros carbohidratos como glicerol y lactosa, impidiendo así su catabolismo. En ausencia de glucosa, la forma fosforilada de la proteina IIAGlu activa a la enzima adenilato ciclasa, aumentando los niveles de AMPc. El AMPc junto con la proteína CRP (CAP) activan la transcripción de un gran número de genes catabólicos. Este sistema PTS para el transporte y fosforilación de azúcares parece estar presente solo en bacterias que utilizan la via Embden-Meyerhof-Parnas (EMP) y esta ausente en bacterias aeróbicas estrictas como Azotobacter y Pseudomonas (57).

A. vinelandii es un organismo aerobio estricto que puede utilizar una gran variedad de fuentes de carbono bajo condiciones diazotróficas (Wong et al 1985). En esta bacteria se ha reportado la ausencia del sistema glucosa PTS (56, 57). El transporte de carbohidratos se lleva a cabo por un mecanismo de transporte activo, que en el caso de la glucosa esta acoplado a la oxidación de malato, vía la cadena respiratoria (2). La glucosa se metaboliza por la vía Etner-Duodorof ED (32, 64, 3).

El sistema PTSNtr (Fig. 16)

En muchos géneros de bacterias se ha reportado la presencia en la region 3" del gene rpoN el cual codifica para el factor sigma σ⁵⁴, de genes que codifican para homólogos de las proteínas Hpr y IIA del sistema PTS (44). A estas proteínas se les denominó Npr y IIANtr. En E. coli se ha demostrado que in vitro estas proteínas participan en una cascada de fosforilación. Sin embargo en la mayoría de los casos se desconoce la función de estos genes. Se ha propuesto que juegan un papel en la regulación de la transcripción de genes dependientes del factor sigma σ⁵⁴. En Alcaligenes eutrophus estas proteínas controlan la acumulación de PHB (46). La enzima I (EINtr) responsable de la fosforilación de Npr se ha identificado en E. coli y es codificada por el gene ptsP. En A. vinelandii están presentes genes que codifican a las proteínas Npr y la enzima IIAntr ligadas al gene rpoN (36), y un gen homólogo a ptsP (Fig. 16). El producto de este gen, la enzima INtr, esta involucrada en la acumulación de PHB y en la protección respiratoria de la nitrogenasa (59) ya que en mutantes ptsP la acumulación de PHB se reduce de manera significativa y son incapaces de crecer en concentraciones bajas de glucosa cuando fijan nitrógeno. La regulación de la acumulación de PHB por PtsP parece que se lleva a cabo a nivel transcripcional, ya que la mutación ptsP disminuye la transcripción de el gen estructural phbB (61). El mecanismo por el cual este sistema PTS^Ntr controla la producción de PHB esta siendo estudiado en nuestro laboratorio. En la Fig. 17 se presenta un modelo donde se resumen los elementos que controlan la expresión de los genes de la biosíntesis de PHB en A. vinelandii.

Del ciclo de vida y el proceso de diferenciación

En condiciones de laboratorio A. vinelandii forma quistes resistentes a la desecación después del crecimiento exponencial, aunque en estas condiciones los quistes constituyen menos del 0.1 % de la población celular. También se puede inducir el enquistamiento de células vegetativas con reactivos específicos como n-butanol ó β-hidroxibutirato (22). El ciclo de vida de A. vinelandii se ha observado al microscopio de luz y electrónico (71, 69, 17, 18) .

Formación de quistes (Animación 1 )

Cuando células vegetativas que son móviles de tamaño grande y en forma de cacahuate se transfieren a medio sólido sin nitrógeno y con 0.2% de β-hidroxibutirato se induce la formación de quistes. Cuatro horas después de la inducción, estas células pierden sus flagelos y sufren una última división celular para dar origen a dos células completamente redondas y muy encapsuladas, es decir cubiertas del exopolisacárido alginato. A las 6 horas empieza la secreción desde la superficie de las células de estructuras parecidas a membranas las cuales en aproximadamente 30 horas forman la exina que es la capa más externa que rodea al quiste maduro. Posteriormente se forma la intina que es una estructura que se encuentra en el espacio entre la exina y la membrana celular externa. La culminación de estos eventos es el quiste maduro que consiste de la célula redonda y pequeña con su membrana citoplasmica, una delgada pared celular de ácido murámico. Esta célula ó cuerpo central esta cubierta por dos capas la intina y una exina compuestas principalmente de lipoproteinas y alginato, y dentro de ella se observan numerosos gránulos de PHB.

Germinación

La germinación es el proceso por el cual los quistes metabólicamente inactivos sufren los cambios necesarios para convertirse en células vegetativas. Esta ocurre cuando los quistes se incuban en medio Burks sin nitrógeno en condiciones aeróbicas con una fuente de carbono como glucosa o sacarosa. La germinación ocurre a 30°C. Microscópicamente la primera evidencia de la germinación es la pérdida gradual de refractabilidad que se observa en el microscopio de contraste de fases. Este proceso dura de 4 a 8 horas, durante este tiempo, el cuerpo central se hincha y ocupa el volumen de la intina (24) A las 8 horas, el crecimiento del quiste dentro de la exina causa una fractura de esta capa y emerge una célula en división todavía no mótil. Los componentes de la exina no parecen ser utilizados durante la germinación ya que se pueden observar como cáscaras vacías y rotas. Las células vuelven a ganar motilidad antes de la primera división post-germinación.

Propiedades de los quistes

Los quistes son células metabólicamente inactivas que son considerablemente más resistentes a condiciones deletéreas o adversas que las células vegetativas. En el laboratorio son viables por mas de 10 años cuando se mantienen en suelo seco (68), sugiriendo que la resistencia a la desecación les permite sobrevivir en estas condiciones en la naturaleza.

Cambios metabólicos durante el enquistamiento

La diferenciación de células vegetativas a quistes implica que todo un programa morfogenético debe estar codificado en el genoma de Azotobacter. Existe una relación directa entre el grado de acumulación de PHB y el porcentaje de enquistamiento (63). Se ha propuesto que la acumulación intracelular de PHB y su subsecuente depolimerización son prerequisitos necesarios para el enquistamiento (22). La formación de quistes ocurre de manera casi sincronizada cuando las células vegetativas son transferidas a medios sólidos en presencia de n-butanol ó β-hidroxibutirato. Este último es un producto de la degradación del PHB (71, 58), y se ha propuesto que β-hidroxibutirato induce el enquistamiento porque cuando se adiciona al medio se acumula al interior de la célula lo que resulta en condiciones parecidas a condiciones de degradación del PHB. De manera que la inducción del enquistamiento por n-butanol puede deberse a su conversión a b-hidroxibutirato (58). De hecho durante la inducción con n-butanol se induce el gen aldA que codifica para una aldehido deshidrogenasa esencial para el metabolismo de n-butanol, y mutantes que carecen de esta aldehido deshidrogenasa, son incapaces de formar quistes en n-butanol pero pueden formar quistes en β-hidroxibutirato (16). El enquistamineto inducido por β-hidroxibutirato, ó el que ocurre en cultivos con glucosa en fase estacionaria va acompañado de la formación de una familia de 5-n-alkylresorcinols y 6-n-alkylpirones los cuales reemplazan los fosfolípidos normales de la membrana y que también son componentes de la capa exina (51-53). La presencia de alkylresorcinols en bacterias es poco común, estos lípidos fenólicos se encuentran también en algunas plantas formando parte de una capa de cera que protege a las semillas. Todos estas observaciones implican que durante el enquistamiento A. vinelandii parece sufrir un cambio de metabolismo de carbohidratos a metabolismo de lípidos. Otros cambios metabólicos que ocurren al inducir el enquistamiento incluyen un abatimiento de la fijación de nitrógeno y de la alta tasa respiratoria.

Los genes algU y algR participan en el control del enquistamiento

El factor sigma^E o AlgU que controla la síntesis de alginato a través de controlar la transcripción del gen algD, también es esencial para la formación de quistes. Existen condiciones que disminuyen la actividad de este factor a niveles que permiten sintetizar suficiente alginato para formar las capas del quiste, pero que no permiten la formación de quistes maduros, sugiriendo que este factor tiene un papel en el enquistamiento independientemente del papel estructural del alginato en el quiste maduro (31). Por lo tanto AlgU podría reconocer y activar promotores de genes cuyos productos son esenciales para la formación de los quistes.

El regulador de respuesta AlgR que participa en la regulación de la producción de alginato también regula la formación de quistes. Mutaciones en el gen algR abaten completamente la capacidad de formar quistes maduros. Cuando se observan al microscopio electrónico las estructuras de los quistes formados por cepas con mutaciones en algR se observa que el proceso de diferenciación esta bloqueado en el paso de formación de la exina (38). Pseudomonas aeruginosa, una bacteria patógena productora de alginato, tiene homólogos de los genes reguladores algU y algR, y sus productos son indispensables para la síntesis del alginato (11). En esta bacteria, los genes estructurales de la biosíntesis de alginato están físicamente organizados como en A. vinelandii, sin embargo su organización y control transcripcional es diferente al descrito para A. vinelandii (28). En P. aeruginosa, los genes biosintéticos forman un solo operón el cual es transcrito a partir de un solo promotor localizado arriba del gen algD. Este único promotor es reconocido por AlgU y la transcripción de este operón es activada directamente por AlgR. De manera similar en A. vinelandii AlgU y AlgR son esenciales para el enquistamiento por lo que es posible que la proteína AlgR active genes de enquistamiento (enq) que son reconocidos por el factor sigma AlgU (Fig. 18).

Conclusiones y perspectivas

El conocimiento hasta ahora obtenido en las áreas de fijación biológica de nitrógeno y la producción de polímeros en A. vinelandii, ha contribuido a entender los mecanismos que permiten a un microorganismo aerobio estricto fijar nitrógeno, así como sobre los mecanismos globales y específicos que controlan la síntesis y modificación de polisacáridos y poliésteres en bacterias. Si embargo a pesar de los avances, quedan todavía muchas preguntas que deben contestarse, sobre todo en el campo de las vías de señalización que conducen a la activación de los genes de la biosíntesis de polímeros, así como los factores del medio ambiente responsables de encender estas vías de señalización. El conocimiento en el área de la genética de la diferenciación de A. vinelandii, apenas empieza a emerger, por lo que las preguntas a contestar son todavía muchísimas, por ejemplo no se han identificado las actividades enzimáticas ni los genes que participan en las vías de metabolismo de lípidos durante la diferenciación, como por ejemplo la vía de síntesis de alkilresorcinoles, y por supuesto las vías de señalización responsables de encender la expresión génica que conduce a la formación de los quistes maduros.

Vale la pena mencionar que la investigación en estas áreas también genera conocimiento que puede ser útil para el diseño y construcción de cepas que puedan ser utilizadas en la obtención industrial de polímeros.

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