Valeria Souza, Martha Rocha, Luisa Sander y Luis E. Eguiarte

Departamento de Ecología Evolutiva, Instituto de Ecología, Universidad Nacional Autónoma de México. Apartado postal 70-275, C.U., C.P. 04510, México D.F., México.

Entendiendo a E. coli.

a) Taxonomía y posición filogenética de E. coli.

Escherichia coli es probablemente el organismo mejor conocido del mundo, ya que se ha utilizado como modelo para estudiar todo tipo de aspectos de genética y fisiología. Su genoma entero se conoce desde hace algunos años (Blattner et al., 1997) y su biología general esta bien estudiada, como demuestran claramente las diferentes ediciones del trabajo clásico coordinado por Neidhardt et al. (1987; 1996). También ha sido utilizada como organismo modelo en estudios de evolución experimental y genética de poblaciones para entender la acción de las diferentes fuerzas evolutivas a corto y largo plazo (i.e.,Papadopouslos et al., 1999; Souza et al., 2000).

Veamos algunas de sus características generales. E. coli es un bacteria Gram negativa típica de la familia Enterobacteriaceae. El análisis de 16rRNA muestra que pertenece a la subclase de proteobacterias γ, misma que se encuentra muy relacionada a las otras proteobacteria (α, β, δ) y a las cianobacterias (Logan, 1994). La subclase de proteobacterias g, incluye además a organismos patógenos de humanos, como son Shigella, Samonella, Vibrio y Haemophilus. Las bacterias de la familia Enterobacteriaceae se caracterizan por ser capaces de respirar facultativamente: anaérobicamente en el interior del intestino y aerobicamente en el ambiente exterior. Gracias a esta capacidad muchos de los miembros de esta familia son de vida libre, mientras que otros tantos son principalmente comensales de animales invertebrados y vertebrados o son patógenos de plantas (Logan, 1994).

En particular, E. coli prefiere utilizar azúcares sencillos como la glucosa, produce ácido y gas en presencia de lactosa y como E. coli no es una bacteria fijadora, requiere nitrógeno soluble como el sulfato de amonio (Brenner, 1984).

b) Su genoma, plásmidos y biología evolutiva básica.

La cepa de laboratorio K12 de E. coli ha sido intensamente utilizada como un organismo modelo en gran cantidad de estudios, y una variante de esta cepa, la MG1655, fue elegida para su secuenciación (cuando menos otra K12 en Japón y una cepa patogénica del serotipo O157:H7 de esta especie también han sido secuenciadas, pero los datos no estaban disponibles en el momento cuando se escribió este artículo). Esta cepa contiene 4,639,221 pares de bases de DNA circular de doble cadena. El 87.8% de este genoma codifica para proteínas, el 0.8% codifica para RNAs estables y 0.7% consiste en DNA repetido que no tiene función conocida. Esto nos deja con alrededor del 11% del genoma con funciones de regulación. Dentro de los 4,288 ORF descritos, existen un 38% con función desconocida. El contenido promedio de GC es del 50.8%. Debido a que un número importante de genes (al menos 755 genes en el cromosoma de la cepa MG1655) contienen diferentes proporciones de GC y un índice de uso de codones diferente al del resto del genoma, se considera que estos genes de E. coli han sido adquiridos por transferencia horizontal (Lawrence y Ochman, 1998). Entre estos genes con contenido GC diferentes destacan las llamadas "islas de patogenicidad" (regiones donde se encuentran los genes que confieren capacidades patógenas a una bacteria) (Ochman et al., 1999). Sin embargo, es posible que otras cepas de E. coli tengan fuertes diferencias en su estuctura genómica, ya que se sospecha que los mapas no siempre son colineales y hay gran variación en el tamaño del genoma entre cepas (Shu-Lin et al., 1993; Bergthorsson y Ochman, 1995). Esto es particularmente notable en la cepa patógena O157:H7, la cual tiene una tasa de mutación mayor, debido a un sistema de reparación por escisión defectuoso (Le Clerc et al., 1996).

El análisis comparativo entre genomas bacterianos secuenciados (i. e. Blattner et al., 1997; Decker et al., 1998; Kalman et al., 1999; Parkhill et al., 2000) y el estudio de la estructura genética de numerosas bacterias (Caugant et al., 1981; 1983; Istock et al., 1992; Musser et al., 1986) indica de manera definitiva que las bacterias no son el organismo estable que Gould (1994) sugiere - "the most salient feature of life has been the stability of its bacterial mode from the beginning of the fossil record until today and, with little doubt, into the future time so long as the earth endures" -. La visión de Gould es miope, ya que si bien las bacterias han cambiado poco morfologicamente, su genoma es una entidad dinámica y cambiante, que no ha dejado de evolucionar aunque manteniendo el tamaño reducido y una aparente baja complejidad. Por otra parte, es interesante señalar que los datos obtenidos hasta la fecha señalan que el genoma bacteriano consiste en un mosaico de genes con diferentes historias. Se ha sugerido que al menos 17% de los genes de E. coli son adquisiciones foráneas relativamente recientes (Lawrence y Ochman, 1998), con una tasa de transferencia horizontal de aproximadamente 16kb cada millión de años (Martin, 1999).

Si el genoma de E. coli es dinámico, sus elementos extracromosomales (plásmidos) son aún más. Esta bacteria puede sobrevivir sin ningún plásmido o tener un buen porcentaje de su genoma total en plásmidos (Hopwood y Chater, 1989). Se han descrito cerca de 300 plásmidos diferentes en E. coli (Boyd et al., 1996). El número y tipo de plásmidos dentro de una célula esta regulado por dos fuerzas: el número de réplicas de un mismo plásmido dentro una bacteria - fenómeno controlado en parte por el mismo plásmido- y la entrada de nuevos plásmidos por conjugación o trasformación. Se ha reportado que los plásmidos pueden transferirse entre células de diferentes orígenes filogenético (i.e., géneros e inclusive familias diferentes comparten plásmidos), dándole capacidades nuevas e instántaneas a su receptor (Lewin, 1998). Sin embargo, es interesante señalar que existe incompatibilidad entre plásmidos de un mismo grupo, por lo que no pueden ingresar a una bacteria dada plásmidos nuevos pertenecientes a un grupo ya existente (Madigan et al., 2000). La información contenida en estos elementos extra-cromosomales es variable, ya que en ellos se puede encontrar información para asimilar azúcares raros, para produccir colicinas -substancias alelopáticas que matan a posibles competidores de la misma especie- resistencias a antibióticos y a metales pesados, inmunidad contra fagos y colicinas, genes que codifican para intercambio genético y fimbrias relacionadas con la patogenicidad y toxinas, entre otros (Lewin, 1998).

La gran plasticidad genómica de E. coli le confiere una plasticidad ecológica notable, ya que gracias a ella pueden adaptarse rápidamente a vivir en diferentes ámbitos y pueden de esta forma pasar de ser organismos de vida libre a ser comensales mutualistas del colon en los animales de sangre caliente, hasta ser un patógenos mortales en humanos y animales.

Ecología Evolutiva de E. coli

a) Dónde vive, qué come, cuántos hijos tiene

Generalmente se considera que el habitat "normal" de E. coli es el colon de organismos de sangre caliente (aves y mamíferos)(Souza et al., 1999), y que aunque se pueden localizar estas bacterias en el medio externo, tradicionalmente se consideraba que su presencia representaba contaminación fecal, ya que se sospechaba que no se podía reproducir en el medio exterior (Atlas, 1990). Sin embargo, resultados recientes indican que esto es falso. Existen E. coli que viven en otras partes del tracto digestivo, como las E. coli patógenas que pueden habitar en la sangre y en el tracto urogenital. Adicionalmente, es posible encontrar poblaciones de E. coli en vertebrados de sangre fría. Por otro lado, también se han encontrado cepas particulares en ambientes acuáticos, especialmente los que son ricos en compuestos orgánicos como en el desagüe (Cerritos, 1999; Parveen et al., 1999; Cruz, 2000). En estudios que utilizan marcadores genéticos, como alozimas y ribotipos, se ha descrito que la diversidad genética es mayor en estos cuerpos de agua y que las cepas encontradas en el ambiente exterior no siempre son las mismas que existen en el colon de los posibles hospederos (Puppo y Richarson, 1995; Cerritos, 1999; Parveen et al., 1999; Cruz en revisión). También se ha demostrado que estas poblaciones ambientales pueden incrementar de densidad poblacional en el tiempo, indicando que crecen y sobreviven en estos ambientes externos. Además, tenemos datos que sugieren que existen cepas de E. coli que sobreviven y se replican en el suelo (A.Valera com. pers.).

La densidad de E. coli en en intestino grueso es de uno a diez millones de células por gramo de colon. Esto hace de E. coli un componente menor de la flora predominantemente anaerobia de esta parte del intestino, donde la densidad bacteriana total es de unas 10¹¹ células por gramo (Selander et al., 1987). E. coli es una de las primeras especies que coloniza al mamífero recién nacido, adquiriendo las primeras cepas del canal de parto y de las heces de su madre (Bettelheim, 1994). Las colonizaciones posteriores se deben por lo general a la ingestión de alimentos contaminados. Usualmente hay una cepa dominante de E. coli por hospedero, sin embargo la aparición de nuevos genotipos, ya sea por mutación o por ingestión, hace que esta dominancia sea sólo temporal y que la dinámica este dictada por procesos tanto aletorios (deriva génica) como adaptativos (selección periódica, como los veremos más adelante (Levin, 1981; Caughant et al., 1981)). En el intestino se estima que hay una bipartición al día, mientras que en medio de cultivo rico en el laboratorio se tienen 6 biparticiones al día (Selander et al., 1987) Muy bajo si se considera que se puede dividir cada 20 minutos. Se considera que en condiciones bajas de nutrientes como el agua y el lodo, el tiempo de bipartición de E. coli es aún menor que en el intestino.

b) Genética de poblaciones de E. coli.

Los estudios clásicos de genética de poblaciones de E. coli indican que esta bacteria tiene una gran diversidad genética (H desde 0.47 (Selander y Levin, 1980), hasta 0.52 (Whittam, et al., 1983), donde H es una medida de variación genética que va de 0, si no hay variación, a un máximo de 1, donde cada individuo de la población presenta una forma alélica diferente). En estos trabajos se estimó que el desequilibrio de ligamiento (esta es una medida estadística que es 0 si lo genotipos se encuentran en las proporciones que se esperan al azar a partir de las frecuencias alélicas de cada gene) de E. coli asociada a humanos y animales domésticos es cercano al máximo (D=1), indicando que sólo se encuentran unos cuantos genotipos de todos los posibles, por lo que al estimar indirectamente el parámetro de recombinación se encontró que este es muy bajo (c=10^-9), cercano a la tasa de mutación (m= 10^-10, Selander y Levin, 1981). Concluyendo que en E. coli la recombinación (sexualidad) es un fenómeno relativamente raro en la especie (Selander y Levin, 1980, Caugant et al., 1981, Selander et al., 1987, Dykhuzien y Green, 1991, Souza et al., 1992). A partir de estos datos, y usando la teoría de la genética de poblaciones, se calculó un tamaño efectivo (Ne) cercano a 10¹⁰, el cual es relativamente bajo en relación al total de E. coli que se esperan en el mundo (10²⁰, Milkman y Stolzfus, 1988), pero lo suficientemente alto para asegurar que la selección natural sea la fuerza evolutiva dominante en su evolución (Selander et al., 1987; Souza et al., enviado). A pesar de la falta de recombinación, la alta diversidad genética observada con alozimas se podía explicar por selección periódica y adaptación a nichos particulares (Levin, 1983; Gutman 1997). Por selección periódica se entiende el fenómeno en el cual un genotipo desplaza selectivamente a los otros presentes en la población. Esto sólo sucede si tenemos poblaciones asexuales, por lo que al surgir una mutación favorecida por la selección natural se reemplaza no sólo ese gen en la poza génica, sino el genotipo completo.

Con la finalidad de entender mejor que es E. coli, nosotros decidimos organizar una colección de cepas de varios continentes (América, Antártida, Australia) asociadas a mamíferos y aves silvestres en un esfuerzo por obtener una mejor representación de la variación genética total de esta especie. Para poder tener una visión adecuada del ciclo de vida de E. coli, también aislamos cepas del ambiente (aire agua y suelo), tanto de la Ciudad de México como del ambiente de varias cuevas en Yucatán. Esta colección cuenta actualmente con más de 2000 cepas y la denominamos IECOL (Instituto de Ecología, Colección de E. coli). Como una primera aproximación a la caracterización de esta colección, decidimos analizarla utilizando electroforésis de 12 genes polimórficos (alozimas) en acetato de celulosa, las cepas fueron además biotipificadas (incluyendo para este análsis el uso de 12 azúcares y la resistencia a 6 antibióticos), se determinó en número y tamaño de sus plásmidos y los serotipos. En un primer análisis electroforético de 215 cepas asociadas a mamíferos de Australia, Venezuela, Costa Rica y México, obtuvimos las frecuencias alélicas, y encontramos que la diversidad es aún más alta que la reportada a partir de cepas humanas (H=0.68; Souza et al., 1999). Asimismo, encontramos que existe una mayor diversidad genética en las cepas de México que en las de Australia y que cada grupo de organismos hospedero presenta principalmente cierto grupo de cepas evolutivamente relacionadas. En otro estudio encontramos que las cepas de México son las que presentan estadísticamente un menor desequilibrio de ligamiento (Souza et al., enviado), lo cual sugiere que E. coli no es un organismo tan clonal como sugerían los datos de cepas derivadas de humanos. También observamos que existen grupos de cepas, como las asociadas a los carnívoros, roedores o murciélagos, donde la recombinación es más frecuente. Estas diferencias se pueden deber en parte a los hábitos de los hospederos (por ejemplo, los carnívoros podrían muestrear muchas bacterias al ingerir animales con todo y flora intestinal) y a las diferentes presiones de selección que existen dentro de cada hospedero (por ejemplo, el ambiente intestinal humano puede presentar antibióticos). Sin embargo, al estimar la tasa de recombinación por otros medios, como el análisis de secuencias (Guttman y Dykhuizen, 1994; Peek et al., enviado) y comparando la congruencia entre árboles filogenéticos obtenidos a partir de secuencias de diferentes genes y con los derivados del análisis de gran cantidad de loci (como alozimas y ribotipos) (i.e., Lecointre et al., 1998) se observó que la recombinación intragénica e intergénica es un fenómeno más importante que la mutación en E. coli.

Historia natural de la patogenicidad en E. coli.

Existen muchas enfermedades en el ser humano causadas por bacterias. Sin embargo, es muy notable el hecho de que existe un número reducido de estrategias que siguen estos procariontes para convertirse en patógenos (Finlay y Falkow, 1996; Goosney et al., 1999). Para poder entender éstas estrategias, además del enfoque molecular y epidemiológico, recientemente se ha intentado utilizar un enfoque evolutivo para entender la interacción microbio-hospedero. Este enfoque a ayudado a estudiar la evolución de la patogénesis microbiana (Falkow, 1997).

Dentro de las bacterias causantes de enfermedades gástricas importantes, también se encuentra Escherichia coli, la cual puede ser responsable de diarreas y de enfermedades que llegan a ser muy graves, como la colitis hemorrágica y síndrome urémico (Donnenberg y Kaper, 1992). Sin embargo, existen varias maneras de interaccionar con el epitelio intestinal y de causar diarrea por E. coli.

Las cepas enterotoxigénicas (ETEC) son consideradas el prototipo de la cepa diarréica. Estos organismos colonizan la superficie de la mucosa del intestino delgado por medio de fimbrias. Estas fimbrias tienen una regulación compleja, ya que los genes estructurales (CS1, CS2, CS3) se encuentran en el cromosoma pero su regulación depende de un gen plasmídico (rns) (Caron et al., 1989). Una vez adheridas, las cepas ETEC elaboran las toxinas LT y/o ST, las cuales son transportadas al interior de la célula del hospedero causando una diarrea osmótica (Fig. 1).

Las cepas de E. coli tipo enteropatogénicas (EPEC) resultan particularmente interesantes para estudiar el problema de evolución de la patogénesis por la estrecha relación que se da con sus hospederos. Estas cepas causan un patrón característico de lesión localizada (EA), donde las bacterias se adhieren al tejido y borran las vellosidades del intestino (Fig. 1). Los genes asociados a esta lesión se encuentran tanto en un plásmido (EAF), como en el cromosoma (dbsA), y en una isla de patogenicidad cromosomal (locus LEE). Hablaremos de ellas con mucho detalle en el inciso siguiente.

El cuadro clínico causado por las E.coli enterohemorrágicas (EHEC) es considerado como una enfermedad emergente, ya que hasta 1993 no se había reconocido como un peligro para la salud pública. En ese año se presentaron un número inusual de niños con fallas renales en los hospitales cercanos a Seattle, Washington (EUA). Los niños habían tenido una fuerte y dolorosa diarrea con sangre antes de presentar daños al riñon. Varios niños murieron de manera similar en otros estados de EUA. Todos los casos tuvieron como común denominador el consumo de carne de hamburgesas contaminada con E. coli serotipo O157:H7 de una misma cadena de comida rápida (Knight, 1993). Posteriormente varias otras epidemias han sido causadas por este serotipo, se han reportado en varios de los paises desarrollados (EUA, Canada, Inglaterra, y Japón) y en el hemisferio sur (Chile, Argentina, Sudáfrica). Algunos de estos brotes han sido causados por carne de res mal cocida, aunque también ha habido epidemias por agua de pozo contaminada, por agua de alberca y por sidra no pasteurizada. La enfermedad causada por esta cepa es especialmente virulenta, ya que induce una toxemia generalizada con diarrea hemorrágica y en los casos más graves, la muerte, la cual se debe a un síndrome urémico hemolítico (Nataro y Kaper, 1998).

Las cepas EHEC tienen el mismo mecanismo de adhesión y la misma "isla de patogenicidad" que las EPEC (Fig. 1), sin embargo, debido a la presencia de un plásmido de 60M daltones, estas cepas producen una toxina hemolítica. Las EHEC son capaces de invadir la célula eucarionte, entrar en la corriente sanguínea y secretar toxinas similares a las de Shigella (stxA, stxB), las cuales están codificadas por el cromosoma (Nataro y Kaper, 1998).

Las cepas de E. coli enteroagregativas (EAEC) causan diarrea persistente en niños. Al igual que las cepas ETEC, estas células producen toxinas ST y hemolisinas y se adhieren al intestino delgado y no son invasivas (Cravioto et al., 1991). Sin embargo a diferencia de las ETEC, estas cepas están típicamente cubiertas por estructuras fibrilares delgadas que se suponen son estructuras adhesivas que les permiten agregarse en cúmulos (Fig. 1). Estos filamentos delgados son muy similares a los observados en Salmonella (Salyers y Whitt, 1994). Sin embargo, varios estudios sugieren que las cepas EAEC son genética y fenotipicamente heterogéneas (Nataro et al., 1995; Czeczulin et al., 1999).

Las cepas de E. coli enteroinvasivas (EIEC) son muy similares a Shigella spp. en su bioquímica y patogénesis, ya que como esta especie son lactosa negativa (todas las otras cepas de E. coli son Lac+), no son móviles y son negativas en la prueba de lisina decarboxilasa (Nataro y Kaper, 1998) y además presentan un plásmido idéntico a Shigella que contiene los genes de invasión (vir). Las EIEC son capaces de causar diarrea líquida, similar a la causada por ETEC y ocasionalmente (al igual que Shigella ), pueden invadir las células del intestino del hospedero (Fig. 1) y causar disentería. Las EIEC causan epidemias relacionadas a la contaminación de agua y alimentos (Salyers y Whitt, 1994).

Las cepas de E. coli patógenas más difíciles de clasificar son las difusamente adherentes (DAEC). Estas cepas causan estructuras como dedos en las células epiteliales del intestino, las cuales embeben a la bacteria (Fig. 1). Estas cepas son causantes de diarrea líquida, principalmente en niños (Salyers y Whitt, 1994; Beinke et al., 1998). En cepas aisladas de pacientes en Brasil y Alemania se observó que estas cepas secretan homólogos a la señal de transducción espB observada en las cepas EPEC, por lo que se sugiere la presencia de una isla de patogenicidad similar a LEE (Beinke et al., 1998; Scaletsky et al., 1999).

La versatilidad bioquímica de E. coli le permite no sólo invadir el tracto digestivo, sino también el sistema urogenital, causando infecciones. Las cepas uropatogénicas (UTI) son dispersadas en las comunidades (colegios, internados, centros de trabajo y recreación), siendo el grupo más suceptible las niñas menores de 10 años y las mujeres de 20 a 40 años. Infecciones causadas por UTI son muy raras en hombres. Las infecciones causadas por estas bacterias causan normalmente cistitis, aunque en ocasiones pueden llegar a causar pielonefritis al invadir el riñon. Las cepas UTI presentan una isla de patogenicidad (PAI) inserta en el mismo sitio que el LEE. Esta isla contiene los genes de las adhesinas (pap) y la toxina hemolítica (hyl) (Salyers y Whitt, 1994). Por otra parte, se ha descrito que las cepas que tienen, además de la isla de patogenicidad, fimbrias tipo 1, son las que pueden colonizar más exitosamente el tracto urogenital, con lo que se incrementa la patogenicidad de estas cepas (Connel et al., 1996).

Evolución de la patogenicidad: La isla de patogenicidad LEE

a) EPEC como modelo de patogenicidad

En este primer acercamiento a la evolución de la patogenicidad en una bacteria vamos a tomar como modelo a Escherichia coli enteropatogénicas (EPEC) que describimos brevemente en el inciso anterior. Estas cepas patógenas están adaptadas a hospederos humanos y a otros mamíferos y causan diarrea aguda (y gran mortandad en niños menores de 2 años en países en vías de desarrollo). La razón por la cual la incidencia en adultos es muy baja aún no es clara, pero podría deberse a la pérdida de receptores específicos con la edad o por desarrollo de inmunidad. Las EPEC raramente producen infecciones extraintestinales. Las epidemias son esporádicas y suceden en hospitales o guarderías. Cuando son adultos los infectados, se supone que se debe a la ingestión de gran cantidad de inóculo o a individuos inmunológicamente depauperados (Nataro y Kaper, 1998). La transmisión de las EPEC es fecal-oral y generalmente a través de manos y otros objetos contaminados. Se han encontrado serotipos característicos de EPEC en aire, agua, comida y en los excrementos de animales que pueden servir como reservorios de estas bacterias (Nataro y Kaper,1998).

Las EPEC han sido caracterizadas en base a su serotipo, a su histopatología - que puede detectarse mediante biopsias del epitelio intestinal- y a la ausencia de la toxina de tipo "Shiga". La histopatología es conocida como "lesión de adherencia y esfacelamiento "borramiento" A/E (del inglés Attachment/Effacement) y será discutida ampliamente más adelante. La presencia o ausencia del plásmido EAF no había sido considerado como un marcador de estas cepas, ya que existen genotipos EPEC que no lo poseen, sobre todo en cepas asociadas a animales (Rocha et al.,1999). Lo que sí está en debate es que si las cepas sin el plásmido EAF pueden considerarse como verdaderos patógenos (Kaper, 1996). Finalmente, en el Segundo Simposio Internacional sobre EPEC se propuso una definición consenso: " las cepas que producen la lesión A/E, negativas para la toxina de tipo Shiga (Stx) y que poseen el plásmido EAF son consideradas como EPEC típicas, mientras que las que no tienen el plásmido son cepas EPEC atípicas" (Nataro y Kaper,1998).

b) Locus de esfacelamiento (borramiento) enterocítico LEE

La histopatología de la mucosa intestinal que causa las cepas EPEC fue incialmente descrita por Cravioto et al. (1979), y fue denominada lesión A/E por Moon et al. (1983). Este fenotipo se caracteriza por el borramiento de las microvellosidades de la mucosa del intestino delgado y la adherencia íntima de la bacteria a la célula epitelial. Los genes que codifican para esta lesión se encuentran juntos formando lo que se ha llamado una "isla de patogenicidad", que en este caso en particular se ha llamado LEE (del inglés Locus of Enterocyte Effacement, locus de esfacelamiento enterocítico). Mc Daniel et al.(1995) reportó a esta isla como una región de aproximadamente 35 Kb que codifica los factores que caracterizan el fenotipo A/E en varios patógenos entéricos, como E. coli enteropatogénica (EPEC), E. coli enterohemorrágica (EHEC) y otros patógenos como Citrobacter rodentium y Hafnia alvei.

Dentro de la isla LEE, los genes eae, esp, tir y esc (Fig. 2) han sido estudiados por varios autores (ver revisión en Nataro y Kaper, 1998 y en Goosney et al., 1999). Los genes eae han sido asociados a la secreción de una proteína de 94 a 97 kilodaltones llamada intimina y que es responsable de la adherencia íntima de la bacteria al epitelio intestinal. Este fue el primer gen de virulencia que fue confirmado en las cepas EPEC (Jerse et al.,1990). Se ha demostrado experimentalmente que la intimina estimula la inflamación e hiperplasia del intestino, favoreciendo la colonización de estas células en el intestino delgado (Higgins et al., 1999). Estudios recientes indican que existen tres alelos de esta proteína (α, β y γ), siendo cada uno de ellos característicos de un grupo clonal de cepas EPEC y EHEC (Mc Graw et al., 1999). Los genes esp son los responsables de la secreción de proteínas necesarias para activar las señales de transducción a través del epitelio (Kenny y Finlay,1995). EspB es la señal de transducción que es exportada por el sistema de secreción tipo III y entra al citoplasma de la célula intestinal donde destruye el citoesqueleto (Taylor et al., 1998). La regulación del operón esp depende de que E. coli se encuentre en fase logarítmica de crecimiento, del contacto con la célula intestinal y de la concentración de Ca²⁺ y Mn²⁺ (Beltrametti et al., 1999). Mutaciones de la cepa EPEC E2348/69 en la región del gen eae resultan en una virulencia atenuada, sin embargo, mutaciones en el locus espB eliminan la formación de la lesión A/E (Jarvis et al. 1995). Recientemente se propuso la existencia de una proteína producida y exportada por las EPEC que después de ser fosforilada es insertada en la membrana del epitelio intestinal del humano y sirve como receptor de la intimina. Esta proteína ha sido llamada Tir (Translocated intimin receptor) (Kenny et al.1997). Anteriormente esta proteína, conocida entonces como Hp90, se le atribuía, equivocadamente, un origen epitelial (Rosenshine et al., 1992). Investigaciones recientes indican que eae no sólo interactúa con esta proteína sino también con un receptor para la intimina del hospedero (Hartland et al., 1999). Se ha demostrado que tir, al igual que eae presenta una marcada heterogeneidad en sus secuencias y se sugiere que la covariación de estas dos proteínas ayuda a evadir a la respuesta inmune sin comprometer la interacción adhesina-receptor (Paton et al., 1998). Finalmente, el grupo de genes esc pertenece a un sistema de secreción de tipo III que codifica para las proteínas responsables de la exportación de factores de virulencia. Este sistema de secreción es homólogo al sistema de secreción de Yersinia pestis (Isberg et al., 1987) y es dependiente del contacto de la bacteria con la célula del hospedero. Las proteínas secretadas o proteínas efectoras tienen un efecto directo sobre la célula hospedera y la modifican para beneficio del patógeno. Los datos publicados, derivados de unas cuantas cepas humanas, sugieren que en general los genes que codifican el sistema de secreción están ubicados en islas de patogenicidad y, debido a su baja diversidad y alta homología entre patógenos muy diversos, se sugiere que son producto de la transferencia horizontal. Dada su homología con los genes flagelares, existe la hipótesis de que este sistema de secreción se originó de ese grupo de genes (Mecsas y Strauss, 1996).

c) Plásmido EAF (EPEC attachment factor)

Además de los factores cromosomales, se requiere de un plásmido para que se origine la lesión completa de adherencia y borramiento en las EPEC. Estas bacterias se adhieren a la superficie de la mucosa intestinal en grupos discretos (Fig. 2 y 3), un fenómeno conocido como adherencia localizada (LA). Basándose en estas observaciones, parece evidente que las bacterias interactúan entre si además de interactuar con la superficie del epitelio. Girón et al. (1991) identificaron unos filamentos en las EPEC que se agregan formando un pilus, el cual se enmadeja de tal manera que forma una estructura tridimensonal donde se embeben las bacterias. La producción del BFP (del inglés Bundle-Forming Pilus) se asocia con la presencia de un plásmido de aproximadamente 92 kb, mismo que codifica para factores de adherencia en EPEC y que es llamado EAF (del inglés EPEC Adherence Factor) (Puente et al., 1996). Cepas EPEC que carecen de este plásmido no son virulentas en humanos o se adhieren pobremente a células HEp-2 (Girón et al, 1991). En otro trabajo posterior se sugirió que en este plásmido se encontraba la región reguladora del gen eae, a la cual se le designó como la región per (Gómez-Duarte y Kaper, 1995) (Fig. 2 y 3). Cepas EPEC curadas de este plásmido, o con mutaciones en la región designada como per, presentaban bajos niveles de intimina y deficiencia en producir la lesión A/E . Se ha demostrado que la región per también regula positivamente los demás genes que componen el locus LEE (Gómez-Duarte y Kaper, 1995). La respuesta antigénica de pacientes con el cuadro clínico EPEC a la proteína bfp sugieren que se puede realizar una vacuna contra este determinante de la virulencia (Martinez et al., 1999).

El hecho de que los genes reguladores del LEE se encuentren en un plásmido, que el contenido de G-C de este plásmido sea de 29.6% y que exista una homología de nucleótidos entre la región perD y un elemento transponible, el Tn7, sugieren que esta región fue introducida en EPEC en algún elemento transponible. Reid y colaboradores (2000) sugieren que este evento ocurrió paralelamente en los dos linajes de EPEC que él ha propuesto (EPEC1 y EPEC2).

d) Histopatología de la lesión A/E

La inducción de la lesión A/E en EPEC ha sido descrita con un modelo patogénico de tres etapas (Donnenberg y Kaper, 1992) (Fig. 3). Al comienzo de la infección la bacteria se adhiere a las microvellosidades del epitelio intestinal mediada por el pilus BFP, que como se dijo anteriormente está codificado por los genes plasmídicos bfp. A este primer paso se le conoce como "adherencia localizada". Estudios recientes han concluído que el BFP es necesario para la adherencia entre bacterias, pero no existe prueba definitiva de que el BFP medie la adherencia real a las células epiteliales (Nataro and Kaper, 1998). Se han descrito 14 genes en el plásmido EAF que se requieren para el ensamblaje del BFP (Sohel et al. 1996, Stone et al. 1996) (Fig. 2) y que son regulados también por los genes per y por el gen cromosomal dsbA, que codifica una enzima que cataliza la formación de enlaces disulfuro necesarios para la estabilidad de las fimbrias de tipo IV (BFP) (Zhang y Donnenberg, 1996). Inmediatamente después de la adherencia inicial, las EPEC disparan una serie de rutas de señales en las células epiteliales que van a promover la adherencia íntima de las bacterias: la fosforilación de la proteína Tir de 90 kDa, que tiene como función ser receptor en la membrana de las células epiteliales (Kenny et al., 1997). Esta información genera un aumento en los flujos intracelulares de calcio |Ca⁺²|, inducido por el inositol trifosfato (ITP), que resultan en cambios importantes del citoesqueleto del enterocito debido al rompimiento o polimerización de la actina de las microvellosidades. El ITP resulta del rompimiento del fosfatidil inositol con la enzima fosfolipasa C, la cual parece ser que es activada por la bacteria (Baldwin et al., 1991). El rompimiento de la microestructura de la célula epitelial y la inflamación producida por la respuesta inmune provoca una reacción que desemboca en la formación de una estructura de pedestal en la superficie de la célula epitelial característica de esta patogénesis (Goosney et al., 1999) (Fig. 3). Los genes responsables de estos eventos son los del grupo esp y los del sistema de secreción, los esc. La tercera etapa de la infección es el de la adherencia íntima con la célula epitelial. Para que esto suceda la proteína Tir es translocada de la célula bacteriana a la célula epitelial, donde es fosforilada en sus residuos de tirosina. La proteína Tir se presenta en la membrana epitelial como parte de un pedestal y funcionando así como receptor para la intimina, la cual es codificada por el gen eae (Nataro y Kaper, 1998).

En un trabajo reciente de Hicks et al. (1998) se propone un modelo de cuatro etapas, en el cual la adherencia inicial no está mediada por las fimbrias tipo IV, sino por otro tipo de adhesinas aún no determinadas. Las dos siguientes etapas son iguales que en el modelo descrito arriba, y en la cuarta etapa se propone que las cepas típicas EPEC que expresan el BFP forman colonias tridimensionales capaces de expanderse a lo largo del epitelio. Este hecho podría explicar la formación de la lesión A/E en cepas EHEC, las cuales poseen el locus LEE pero no el plásmido EAF.

Las causas de la aparición de diarrea en individuos infectados con bacterias que pertenecen a serotipos correspondientes a EPEC y EHEC son multifactoriales, por ejemplo, la activación de dos cinasas: la PKC que induce cambios en la secreción de agua y electrolitos por el epitelio, y la fosforilación de la miosin cinasa, que lleva a un aumento de la permeabilidad de la membrana. Estos fenómenos, junto con el borramiento de las microvellosidades del epitelio que impide la función de absorción, son los responsables de la aparición de la diarrea intensa (Nataro y Kaper, 1998).

Modelos ecológicos de la evolución de la patogenicidad

a) Diferentes genes, diferentes escenarios

A partir de nuestros datos de alozimas de las cepas mexicanas, tanto de patógenas como no-patógenas, construímos un fenograma de parentesco con el método de distancia UPGMA (Fig. 4). Hemos utilizado este análisis como marco de referencia para mapear la presencia o ausencia de los genes relacionados con la lesión localizada (A/E) producida por las cepas EPEC y EHEC (Sandner et al., enviado; Rocha et al., enviado). Los genes eae, espB, per y bfp fueron amplificados por PCR y posteriormente mapeados en el árbol de isoenzimas (Fig. 4). Encontramos que los genes eae y espB pueden encontrarse juntos formando parte del locus LEE, o estar de manera independiente en las cepas silvestres de los animales sanos. Estos genes parecen tener otros papeles además de ayudar en la patogénesis, ya que existe un predominio del gen espB en los animales con dietas especializadas, como los artiodáctilos, sirénidos, cetáceos y quirópteros. En contraste, el gen eae es más frecuente en las cepas asociadas a los conejos y Xerartha (armadillos y osos hormigueros). Ambos genes independientes se encuentran distribuídos por todo el fenograma de parentesco. Esto sugiere que eae y espB son genes antiguos en E. coli, y que tienen un papel en la asociación normal con el hospedero (Sandner et al.,enviado).

En una submuestra de 54 cepas (36 de animales y 18 de humanos) se amplificaron con PCR los genes eae, tir y espB (Souza et al., en preparación), se detectó el gen espB en solo 12 de las cepas, el gen eae en 14 de estas cepas y el gen tir en 7 cepas, tanto asociadas a humanos como a muy diversos animales. Se secuenciaron los genes eae, tir y espB detectados y se encontró que los genes eae y tir son sumamente variables y representan a más alelos que los descritos previamente. El gen espB es el menos variable. También se encontró que los genes del LEE se encuentran de manera independiente (sólo 4 cepas presentan los 3 genes y 16 cepas presentan al menos un elemento) y distribuídos de manera más o menos azarosa en un árbol de parsimonia de la secuencia de putP obtenida para esta submuestra (Fig. 5). Por último, se observó en los estudios preliminares, que existe una coasociación entre linajes de eae y tir aunque ésto no es tan claro con espB (L. E. Eguiarte, com. personal). Por otra parte, los genes plasmídicos per, bfp y eaf, sólo se encuentran en las cepas EPEC y EHEC clínicas (Rocha et al., envíado), lo cual nos hace pensar que existió uno o varios eventos de transferencia horizontal que dieron lugar al plásmido patogénico.

b) Mutación y patogenicidad

La mutación es la fuerza básica que genera diversidad en los organismos. Además de esta fuerza existen otros mecanismos que generan diversidad genética en los microorganismos como son la transferencia horizontal y la recombinación intragénica.

Le Clerc y colaboradores (1996) encontraron que la tasa de mutación en cepas EHEC es muy alta, posiblemente por errores en el sistema de reparación. A partir de esta observación, se ha sugerido que en general las cepas patógenas tienen una mayor tasa de mutación que las no-patógenas. Estas altas tasas de mutación estarían favorecidas por la selección, ya que permitirían a las bacterias adaptarse a nichos ecológicos cambiantes (i.e. procesos inflamatorios en los hospederos) y como escape al sistema inmune.

La idea de la hipermutabilidad como una adaptación asociada a la patogenicidad ha sido muy debatida. Existen modelos biológicos y matemáticos que indican que ésto es cierto sólo en circunstancias especiales, como cuando los patógenos sufren cuellos de botella severos o cuando la población inicial esta bien adaptada (Sniegowski et al., 1997; de Visser et al., 1999). Kibota y Lynch, (1996) presentan un modelo donde la hipermutabilidad es inestable como estrategia evolutiva, ya que son más las mutaciones deletéreas que las que llevan al patógeno a adaptarse y escapar del ataque del hospedero. Otros modelos matemáticos sugieren que la mutación puede ser adaptativa si se tienen tamaños poblacionales muy grandes, donde al menos cuatro mutaciones adaptativas son selecionadas para que se fije el gen mutador (Taddei et al., 1997; Tenaillon etal., 1999).

Recientemente, Oliver y colaboradores (2000) estudiaron a pacientes con fibrosis quística sujetos a varios años de altas dosis de antibióticos para combatir a Pseudomonas aeruginosa. Estos pacientes presentan un número significativamente mayor de hipermutantes de P. aeruginosa que la población asociada a enfermos graves infectados con esta bacteria pero sin fibrosis quística. Se sugiere que la hipermutación en esta bacteria es una adaptación que permite tanto resistir a los antibióticos como sobrevivir a la mucosa cambiante del pulmón del paciente con esta enfermedad (Oliver et al., 2000).

En nuestros estudios preliminares sobre la tasa de mutación en las cepas de nuestra colección que presentan la isla de patogenicidad LEE, hemos observado que la presencia del gen eae esta asociada con un ligero aumento en la tasa de mutación inducible. También hemos observado que esta isla es sumamente dinámica y que los genes eae y tir tienen una alta diversidad genética, probablemente debido a una alta tasa de recombinación interna (Perna et al., 1998).

VI. Conclusiones y perspectivas

Un modelo para la evolución de E. coli

Hasta el momento, los mecanismos moleculares y ventajas selectivas que llevan a la evolución de la patogenicidad no están realmente bien comprendidos. Por ejemplo, se considera que para la mayoría de los patógenos bacterianos la virulencia es un proceso multifactorial que requiere principalmente de dos componentes: 1) un entorno genético propicio (i.e. se ha determinado que el serotipo está fuertemente asociado con la patogenicidad (Nataro y Kaper, 1998, Sandner et al., enviado)), y 2) un grupo de genes de virulencia que son únicos en los patógenos (i. e., LEE (Groisman y Ochman, 1996)). En varios patógenos estos determinantes se encuentran en plásmidos, mientras que en otros patógenos la mayor parte de los genes responsables de un cuadro clínico se presentan en el cromosoma en uno o más grupos de genes denominados "islas de patogenicidad" (Salyers y Whitt, 1994). El surgimiento de estas "islas" nos lleva a varias preguntas: ¿Qué ventaja le da a la bacteria tener los factores de virulencia agrupados en el cromosoma en lugar de en un elemento extracromosomal? y ¿cómo se incorporan estos genes al cromosoma? Se sabe experimentalmente que los plásmidos son elementos inestables en el genoma bacteriano, ya que estan sujetos a procesos aleatorios de segregación en la bipartición y que tienen presiones de selección más fuertes que el cromosoma, donde genes medianamente costosos pueden estár ligados a genes ventajosos y permanecer a pesar de su costo (Groisman y Ochman, 1996; Neidhardt et al., 1996; Lewin 1998). Estas islas de patogenicidad pueden ser insertadas en el cromosoma por medio de fagos o elementos transponibles (Groisman y Ochman, 1996). Los bacteriófagos han sido implicados en numerosos estudios como responsables de la inserción de las islas de patogenicidad, ya que estas se insertan preferentemente en genes de ARN de transferencia que tienen sitios de inserción para estos virus (Inouye et al., 1991). Dos posibles razones por lo que los fagos prefieren estos sitios de inserción son que por una parte existen varias copias de estos genes de ARNt en cada genoma, y por otra parte estos sitios son sumamente conservados entre genomas de géneros diversos (Groisman y Ochman, 1996). Por ejemplo, la evidencia sugiere que el locus LEE completo ha sido introducido en el sitio ARNt selC del cromosoma de Escherichia coli por elementos transposables (Mc Daniel et al. 1995). La deleción del LEE del sitio ARNt selC inactiva la síntesis de enzimas que contienen selectocisteína, por lo que las bacterias que pierden el LEE no puede crecer en condiciones anaerobias (Groisman y Ochman, 1996). Sin embargo, no siempre se inserta el LEE en selC, ya que hay evidencias de que el sitio de inserción es diferente en las cepas EPEC y EHEC (Wieler et al., 1997); por ejemplo, de la colección DEC, las EPEC2 y EHEC2 pertenecen a un linaje donde LEE se inserta en el ARNt pheU, mientras que los diferentes linajes EHEC1 y el más ancestral EPEC1 se insertan en el ARNt selC (Reid et al., 2000). El sitio de inserción ARNt selC también es utilizado por la isla de patogenicidad PAI I, la cual contiene los factores de virulencia de la cepas UTI (Boyd y Hartl, 1998).

Estudios con las cepas extraintestinales sugieren que la adquisición de las islas de patogenicidad occurió a partir de un grupo ancestral (B2 y D) y que posteriormente se dispersó a otros linajes por transferencia horizontal (Boyd y Hartl, 1998). Es interesante notar en este estudio que el tamaño del genoma es significativamente mayor en las cepas que tienen las islas, sugiriendo que la adquisición de las islas de patogenicidad está ligada a otros procesos de evolución del genoma, que son independientes de la virulencia, como son eventos de duplicación, inserción de fagos, movimiento de transposones (Boyd y Hartl, 1998). Alternativamente, Pupo et al. (1997) sugieren que la adquisición de los factores de virulencia en E. coli ocurrió polifiléticamente, armándose y desarmándose las islas de patogenicidad en numerosas ocasiones. Apoyando esta hipótesis hay datos que demuestran experimentalmente que existen differencias funcionales y de regulación entre las islas de patogenicidad LEE de las cepas EPEC y EHEC (Elliot et al., 1999). Sin embargo, independientemente del origen mono o polifilético de la virulencia, todos los trabajos publicados sugieren que la isla de patogenicidad LEE es una unidad (Reid et al., 2000). Se considera que dentro de esta unidad hay diversidad, no por diversos origenes, sino porque los genes involucrados en la interacción con el hospedero (eae y tir) se diversificaron por procesos de mutación y recombinación en el interior de la isla (Perna et al., 1998; McGraw et al., 1999, Reid et al., 2000). En esta hipótesis, la adquisición de plásmidos que codifican para factores de virulencia como toxinas y adhesinas ocurrió de manera paralela y progresiva una vez que la isla estaba insertada en un entorno EPEC (Whittam et al., 1993; Reid et al., 2000).

Nuestros datos preliminares de secuencias y los datos de presencia y ausencia de los genes espB, tir y eae en cepas asociadas a mamíferos y humanos, sugieren un panorama radicalmente distinto al que generalmente se ha sugerido en la literatura para el origen del LEE. Tenemos datos que indican que existen cepas de E. coli con varias copias del gen eae, y cepas con diferente números de elementos de la isla, mismos que se encuentran insertos en diferentes sitios del genoma, y por otra parte que existen versiones de los genes de patogenicidad formados con fragmentos de diferentes orígenes. Todos estos datos indican que la isla de patogenicidad LEE está en constante construcción y que los genes que la componen tienen diferentes origenes evolutivos (Souza et al., datos no publicados). Una vez que la isla esta construída, puede ser estable y las bacterias portadoras pueden adquirir por transferencia horizontal otros elementos de virulencia, como el plásmido EAF y las toxinas tipo Shiga, convirtiéndose entonces en cepas patógenas (Rocha, 1998). Una vez que la isla se ha armado, estamos de acuerdo con la hipótesis de Reid y colaboradores (2000) de que la adquisición y evolución paralela de factores de virulencia plasmídicos en los linajes que presentan los diversos tipos de LEE indican que hay una ventaja adaptativa que favorece la adquisición consecutiva de factores de virulencia. Este proceso permitiría así la creación y dispersión de nuevos patógenos, como el caso de la reciente evolución y dispersión de la cepa O157:H7.

¿Qué nos falta de entender y cómo podemos saberlo? si es que podemos saberlo

Consideramos que la evolución de la patogénesis sigue siendo una incógnita. Tenemos varias preguntas sobre la evolución de la patogenesis y en particular sobre la evolución de las cepas EPEC y EHEC: ¿están coevolucionando los genes involucrados con la interacción con el hospedeo del LEE (espB, eae y tir) o existe una relación más bien fortuita y plástica entre estos genes que actúan en concierto? ¿qué tan importante es la mutación en la patogénesis? ¿qué hacen los genes asociados a la patogénesis en las cepas no patógenas? ¿cuál es el papel de la duplicación del eae? ¿cómo es la regulación de los genes del LEE en ausencia del plásmido EAF? ¿cuál es el origen evolutivo del gen regulador per y su papel en la patogénesis? ¿cuál es el costo de estos genes para E. coli y cuáles son sus ventajas adaptativas?

Seguramente las respuestas a estas preguntas van a ser complejas. El análisis cuidadoso de los datos a nivel ADN nos darán una idea sobre la coevolución de los genes espB, eae y tir y del papel de la mutación en la evolución de la patogénesis, así como del origen del gen per. Por otra parte, se puede determinar por medio de evolución experimental (Papadopouslos et al., 1999) el costo evolutivo de tener 1, 2 o n copias de los genes o inclusive de la isla de patogenicidad completa y el estimar número de generaciones necesarios para que estos genes coevolucionen con el resto del genoma. Para resolver las otras preguntas posiblemente se va a requerir de diseños experimentales complejos, utilizando ingeniería genética y pruebas de adhesión en los tejidos propios del hospedero.

Posible utilidad médica y perspectivas

Las cepas EPEC son responsables de un número importante de muertes en niños menores de 5 años en paises en vías de desarrollo, mientras que las cepas EHEC son un problema de salud pública en países desarrollados. Mucho se ha logrado con medidas básicas de higiene y salud pública, como tener fuentes de agua potable limpia, cuidar el tiempo de cocción de los alimentos, realizar campañas de limpieza, lavar las manos de los que preparan los alimentos y diseñando campañas que educan a las comunidades sobre la importancia de la hidratación oral. Sin embargo, el prospecto de una vacuna que proteja a los niños de enfermedades diarréicas es interesante. Los datos que tenemos nos indican que los genes de virulencia del LEE sep no generan una respuesta inmunogénica (Martínez et al., 1999), mientras que los genes eae y tir sí son inmunogénicos, pero son demasiado variables para diseño de vacunas (Paton et al., 1998). Por lo que los mejores candidatos para el diseño de vacunas contra las cepas EPEC posiblemente sean los genes esc y los genes asociados al plásmido EAF. El problema con espB es que hemos observado que se encuentra en E. coli comensal de animales y humanos sanos (Sandner et al., enviado). Dado que los genes plasmídicos están exclusivamente en las cepas clínicas (Rocha, 1998) y que se ha demostrado que bfpA es inmunogénico en niños enfermos (Martinez et al., 1999), estos genes parecen ideales para desarrollar vacunas. Estas estrategias de salud pública pueden ser estudiadas e implementadas en un futuro cercano una vez que conozcamos mejor los niveles y distribución de la variación genética, la estructura de la proteína y cuáles pueden ser los motivos inmunogénicos. Por otra parte, el comprender la estructura genética y la evolución de los genes involucrados en la lesión de adherencia y borramiento causada por E. coli EPEC y EHEC nos ayudará a entender las estrategias que utiliza un comensal para convertirse en patógeno y sólo entonces podemos atacar de fondo los problemas de salud que causan estas bacterias.

Quisieramos agradecer a Alejandro Cravioto por su constante y valiosa colaboración, a Brandon Gaut, Rebecca Gaut y Andy Peek por su apoyo en la secuenciación de varios genes de E. coli y sus valiosas discuciones y finalmente quisieramos agradecer a Armando Navarro y a Aldo Valera por su ayuda técnica. Este trabajo fué financiado por los proyectos CONACyT 27557-M y DGAPA IN-218698. Este trabajo fue realizado durante la estancia sabática de VS y LEE quienes contaron con apoyo tanto de CONACyt como DGAPA para realizar dicha estancia.

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