Edmundo Calva

Instituto de Biotecnología, UNAM

Introducción

El estudio de los mecanismos por los cuales una bacteria como Salmonella typhi puede causar la fiebre tifoidea en el humano, implica comprender cómo este patógeno invade las células, se multiplica y evade la respuesta inmune en el hospedante y, a su vez, cómo el humano responde a esta infección.. Todo ello, no sólo provee información básica sobre procesos biológicos fundamentales a nivel molecular y celular, sino que puede aportar herramientas para el diseño de mejores métodos de diagnóstico y prevención de esta y otras enfermedades de origen bacteriano.

El género Salmonella y su taxonomía

Las salmonellas son bacterias gram-negativas, lo cual significa que no se tiñen de azul con el colorante aplicado en la prueba diseñada por Gram. Esto se debe a que dicho colorante tiñe la pared celular, que en estos casos está cubierta por una membrana externa. Es así que estas bacterias están envueltas por varias capas: la membrana externa, la pared celular (que es diez veces más delgada que en las bacterias gram-positivas), y la membrana interna. La membrana externa e interna delimitan al periplasma. La apariencia de las bacterias en el microscopio es de bacilos, o cilindros con puntas redondeadas.

El género Salmonella fue descrito a principios del siglo XX por el bacteriólogo estadounidense Theobald Smith, recibiendo el nombre por su jefe David Salmon. Las salmonellas son bacterias entéricas, o sea que se alojan en el intestino, y su taxonomía es compleja. Actualmente, el género Salmonella consiste de una sola especie, que ha sido denominada Salmonella enterica. Ésta, a su vez, está formada por siete subespecies, dependiendo de su capacidad para realizar diferentes reacciones bioquímicas. Esta subdivisión ha sido apoyada por varios método de hibridación ADN/ADN y métodos serológicos. Cada subespecie, a su vez, está subdividida en serotipos o serovares, de acuerdo al tipo de antígeno H (flagelar: del alemán hauch, "por el halo producido en un medio de cultivo a raíz del movimiento") u O (somático: del alemán ohne hauch, "sin movimiento"). El antígeno H está conformado por la proteína más abundante del flagelo, que es la estructura que permite el movimiento. El antígeno O está conformado por una cadena repetida de polisacáridos, que forma parte del lipopolisacárido (LPS), que se genera y sobresale de la membrana externa y que actúa como una barrera de protección a agentes externos.

Es así que se han descrito más de 2,375 serovares de Salmonella, que finalmente pertenecen al mismo género en base a su gran identidad en el genoma, de 90% o más.

Salmonellosis

El género Salmonella es el agente causal de diferentes infecciones intestinales, conocidas como salmonellosis. La salmonellosis humana puede dividirse en dos síndromes.

1) La fiebre entérica, que incluye la fiebre tifoidea causada por S. typhi, y la fiebre paratifoidea que es patológica y clínicamente similar a la tifoidea pero con síntomas menos fuertes, causada por S. paratyphi A, B, o C. La fiebre entérica implica una infección sistémica, debido a la invasividad de la bacteria.

2) La gastroenteritis o envenenamiento por alimentos, la cual es la más común de las infecciones, causada por muchos serotipos. Este tipo de infecciones no es acompañada de una infección sistémica. Los serotipos más comunes en la salmonellosis no-tifoidéica son S. typhimurium y S. enteritidis.

Puede también ocurrir una invasión sistémica sin gastroenteritis, sobre todo en individuos inmunocomprometidos, como en el caso de las infecciones intra-hospitalarias. Asimismo, sobre todo para la fiebre tifoidea, puede establecerse la condición de portador asintomático.

Salmonella typhi

La S. typhi es una bacteria anaeróbica facultativa, que puede en ocasiones sobrevivir en bajas condiciones de oxígeno. Pertenece al serotipo 9,12, en base a los epítopes de la tivelosa, el azúcar repetida en su antígeno O. El antígeno flagelar "d" es el más preponderante, aunque algunas cepas de Indonesia poseen otro antígeno denominado "z"; lo que significa que expresan un flagelo muy diferente en secuencia de aminoácidos al encontrado en las cepas de otras regiones del mundo. Además de los antígenos O y H, tiene en su exterior una cápsula de polisacáridos denominada Vi (por antígeno de "virulencia").

Estos bacilos no producen esporas. La mayoría de las cepas son móviles debido a que poseen flagelos peritricos, que rodean a la célula. Interesantemente, existen cepas no móviles en Indonesia, en donde la incidencia de la fiebre tifoidea es más alta.

La S. typhi produce ácido a partir de glucosa, maltosa y sorbitol, sin la producción de gas; pero no fermenta la lactosa, sacarosa, la ramnosa y otros azúcares. Produce nitrito a partir de nitrato y también produce ácido sulfhídrico. Su temperatura óptima de crecimiento es de 37oC.

Epidemiología

S. typhi causa la fiebre tifoidea en humanos, quienes son sus únicos hospedantes. Esto abre importantes preguntas sobre qué genes determinan dicha especificidad, las cuales se podrán abordar en vista de los recientes proyectos de secuenciación del genoma de diferentes serotipos, incluyendo la S. typhi CT18 (con resistencia múltiple a antibióticos proveniente de Vietnam); la S. typhimurium, que se postula reproduce el mecanismo de la infección humana en el ratón; o la S. gallinarum que produce una fiebre enterica en las gallinas.

La fiebre tifoidea prevalece principalmente en países en vías de desarrollo, donde normalmente significa un reto a las autoridades en salud pública. Hay aproximadamente 17 millones de casos anuales con casi 600,000 muertes, principalmente en Asia y África. Las más altas incidencias se encuentran en Indonesia y en algunos puntos del sureste asiático, como Papua Nueva Guinea, en donde puede alcanzar niveles de 103 por cada 100,000 habitantes. En otros lugares en Asia la incidencia es menor. Interesantemente, la mayoría de los casos en las regiones de mayor incidencia, se encuentran en niños en edad escolar de 13 a 19 años de edad.

En México, la incidencia es cien veces menor a la de Indonesia, o sea de 10 por cada 100,000 habitantes. De hecho, de 1989 a 1993, la incidencia disminuyó a la mitad, coincidiendo con las campañas del sector salud para la prevención del cólera. El grupo etario más afectado es el de adultos jóvenes, de 19 a 44 años de edad. Ciertamente, las diferencias en incidencia y en grupos de edad afectados son problemas de interés para la epidemiología, cuya resolución involucra la mejor comprensión de los modos de transmisión y sobrevivencia de la bacteria en el ambiente, el conocimiento más profundo de la respuesta inmunológica del hospedante y de las posibles variaciones genéticas entre los aislados clínicos de S. typhi.

Manifestaciones clínicas

El período de incubación para S. typhi abarca de una semana a un mes, siendo principalmente de dos semanas, a partir de la ingesta de la bacteria proveniente de alimentos o agua contaminada. Se presume que S. typhi invade a través de las células M del intestino, las cuales forman parte del tejido linfoide o inmunológico. Sin embargo, debido a que no se han podido cultivar las células M en el laboratorio, los experimentos de invasividad de Salmonella se han realizado con células epiteliales y macrófagos, los cuales, además, constituyen otros eslabones en el proceso de invasión.

No siempre ocurre la diarrea, pero generalmente hay ulceración. S. typhi se multiplica en el epitelio de la submucosa, después de lo cual entra el torrente circulatorio y se disemina por el cuerpo. La multiplicación ocurre otra vez en el bazo y en el hígado, para que después la bacteria sea liberada en grandes cantidades al torrente sanguíneo. Esta septicemia o invasión generalizada puede confirmarse por el cultivo de la bacteria de la sangre, lo cual refleja una bacteremia. Este estadio de la infección, que puede durar 2 a 3 semanas, se caracteriza por una tos seca, fiebre alta, e intenso dolor de cabeza. La fiebre puede ser cíclica, es decir, la temperatura puede incrementarse por las tardes, acompañada de escalofríos, convulsiones y delirio. De hecho, el nombre de la enfermedad proviene del griego typhus, o "neblina o humo", que probablemente se usó para describir enfermedades febriles que causan alteraciones mentales.

Desenlaces fatales por tifoidea ocurren primordialmente por la ruptura de bazo, ocurriendo un choque séptico ocasionado por el LPS, que estimula la liberación de agentes mediadores de la respuesta inmune como las citocinas. Alternativamente, el 10% de los individuos afectados pueden desarrollar el síndrome de portador sano, excretando continuamente las bacterias del bazo. La hepatitis por S. typhi ha sido documentada.

Sin embargo, no se cuenta con información suficiente para describir en detalle los nichos de sobrevivencia y multiplicación de la bacteria en el humano, excepto que se considera que invade células epiteliales del intestino y, además, se han aislado macrófagos hospedantes de la bacteria. Por otro lado, estudios de la patogénesis (o de los mecanismos para generar enfermedad) de S. typhimurium en ratones, ha conducido a la postulación de la sobrevivencia y multiplicación en ambientes extracelulares. Preguntas fascinantes en este sentido y otras relacionadas a qué factores del hospedante o de la bacteria determinan el cuadro clínico, esperan una respuesta.

Diagnóstico, tratamiento y prevención

El diagnóstico de una infección por S. typhi se realiza a través del aislamiento de la bacteria de sangre, heces, orina, aspirado de médula ósea y bilis. Estas pruebas tardan dos a tres días en aportar los resultados, pues la muestra se diluye en un medio de cultivo y, dado que se estima que un paciente con fiebre tifoidea presenta, por ejemplo, 20 bacterias o menos por ml de sangre, se requiere esperar a que se multiplique lo suficiente para ser observada por turbidez del medio. El cultivo de la sangre es el método más frecuentemente usado para un diagnóstico preciso, aunque su sensibilidad no es más del 90%, incluso cuando se toman tres muestras consecutivas. El cultivo de aspirado de médula ósea es más sensible, pero el procedimiento de extracción del aspirado es delicado y doloroso.

Pruebas bioquímicas y serológicas se realizan para confirmar el diagnóstico. El serodiagnóstico de la infección por S. typhi, usando el ensayo de aglutinación de Widal (reacciones febriles), se basa en la detección de anticuerpos en el suero de los pacientes a los antígenos O (LPS), H (flagelar) y el Vi (antígeno capsular). La limitante de este método es que pobladores sanos de áreas endémicas (en donde la enfermedad es prevalente), presentan títulos (concentraciones) altos de anticuerpos, dificultándose en ocasiones la distinción entre individuos afectados y sanos. Varios otros inmunoensayos en el formato de ELISA, también se han utilizado para la detección de antígenos o anticuerpos específicos en suero. Asimismo, métodos moleculares como la hibridación con ARN ribosomal, con el gen del antígeno Vi, o con la secuencia de inserción IS200, han sido usados. La limitante principal con estos métodos es que requieren de una infraestructura sofisticada de laboratorio y personal altamente especializado, además de que pueden tomar de varias horas a varios días.

Es así que métodos de detección más rápidos, precisos y sencillos, son en extremo necesarios para ésta y otras bacteremias. Ciertamente, la mejor caracterización de antígenos para pruebas inmunológicas, o de genes de virulencia (que determinan la severidad y las características de la enfermedad) para pruebas por amplificación específica de material genético, como la reacción en cadena de la polimerasa o PCR por las siglas en inglés, serán claves para avanzar en este rubro de impacto en salud pública.

La fiebre tifoidea se trata con antibióticos. Los regímenes típicos incluyen amoxicilina, cotrimoxazol y cloranfenicol. Sin embargo, desafortunadamente, la emergencia de cepas con resistencia múltiple a antibióticos se está convirtiendo en un problema global serio. Algunas de las regiones donde estas cepas resistentes se han multiplicado incluyen el subcontinente Indio, Vietnam, Latinoamérica, y Egipto. A pesar de estas cepas resistentes, el cloranfenicol sigue siendo el antibiótico de elección, por su capacidad de infiltración en los tejidos. Las cefalosporinas y quinolonas de tercera generación, constituyen alternativas interesantes.

Las vacunas principales contra la fiebre tifoidea son la oral Ty21a y la parenteral del polisacárido Vi. Ambas proveen una protección hasta del 65-70%, con una inmunidad de 3 a 7 años. Es interesante que la Ty21a es una cepa atenuada por mutagénesis química, por lo que tiene múltiples mutaciones, de las cuales se desconoce las que determinan la atenuación. Ciertamente, una mejor comprensión de los mecanismos básicos, a nivel molecular y celular, de la interacción bacteria-hospedante, permitirá la generación de cepas atenuadas en los genes clave, para obtener el balance apropiado entre la capacidad de generar una respuesta inmune y la atenuación que evite una infección virulenta. De la misma manera, la mejor caracterización de antígenos relevantes durante la fiebre tifoidea, deberá permitir el diseño de mejores vacunas parenterales.

Taxonomía molecular

Se ha utilizado la electroforesis multilocus de enzimas para caracterizar diferentes cepas bacterianas, incluyendo las de S. typhi. En este método se separan por electroforesis los componentes de un extracto celular, bajo condiciones que permiten el ensayo de la actividad de una batería de enzimas. Así, la actividad de veinte o más enzimas se asocia a la banda de la proteína respectiva, que migra en el gel de acuerdo a su carga y tamaño. Las variaciones en el genoma de la bacteria pueden reflejarse en alteraciones en la migración de alguna o más enzimas (que representan varios loci o genes), por lo que pueden obtenerse electroferotipos, o patrones de migración específicos que permiten distinguir una cepa de otra. De esta manera, se ha concluido que S. typhi es de naturaleza clonal, es decir que ha variado poco en la evolución, al menos con respecto a una serie de enzimas básicas de su metabolismo. Otras bacterias muestran más variación, incluyendo otros serotipos de Salmonella.

Otra manera de clasificar a las bacterias es por electroforesis en geles pulsados. En este método, se digiere el genoma de la bacteria con una enzima de restricción que corta poco frecuente, es decir, que produce fragmentos grandes de ADN (mayores a 20 kb o 20,000 pares de bases). Estos fragmentos se separan por electroforesis en gel bajo un campo eléctrico pulsado, lo que hace que el ADN tome diferentes orientaciones alternas durante la migración. Interesantemente, esta metodología mostró que el cromosoma de S. typhi es mucho más variable de lo que se pensaba bajo el concepto de cepas clonales, habiéndose identificado patrones de migración electroforética comunes para cepas correlacionadas geográficamente. También se observó que el cromosoma fluctúa en tamaño entre 3.96 y 4.92 Mb, o millones de pares de bases, es decir, alrededor del 20% . Sin embargo, hasta la fecha, no se ha podido correlacionar estos tamaños con un fenotipo en particular: dicho de otra forma, la S. typhi se comporta de manera clonal en cuanto a su especificidad de hospedante y virulencia. Sin embargo, recientemente, se han descrito casos severos de tifoidea en Papua Nueva Guinea, pero no se ha determinado todavía si la bacteria posee características particulares. De nueva cuenta, hay preguntas interesantes por resolver en cuanto a la relación entre el tamaño y la plasticidad del genoma y la habilidad de la bacteria para sobrevivir en diferentes ambientes y causar enfermedad.

El análisis de plásmidos o moléculas circulares de ADN con replicación autónoma al cromosoma, que se transfieren de manera horizontal entre bacterias, y que codifican para resistencia a antibióticos o factores de virulencia, ha revelado que la gran mayoría de las cepas de S. typhi carecen de ellos. Solamente las cepas con resistencia múltiple a antibióticos las poseen, y éstas han aparecido esporádicamente aunque su presencia se ha incrementado en los últimos años. Otros serotipos de Salmonella poseen plásmidos con frecuencia variable, aunque también hay plásmidos que son específicos de cada serovar. De esta manera, no hay un método general de tipificación de Salmonella por perfil de plásmidos.

Las huellas genéticas de las bacterias, y de las salmonellas en particular, se han generado por la hibridación de fragmentos de ADN con sondas de regiones o genes repetidos en el genoma, marcadas radioactivamente. Los fragmentos de ADN se obtienen por el corte con enzimas de restricción, se separan por electroforesis a través de un gel y se transfieren a un papel filtro. De esta manera, se producen columnas con bandas de diferentes tamaños (o posición en la columna) que distinguen a una cepa en particular; en un formato similar a una barra de identificación en los productos del supermercado. Para este propósito se han utilizado genes ribosomales, de los cuales hay siete copias, o de la secuencia de inserción IS200, de la cual hay convenientemente más de quince copias en el genoma de S. typhi, aunque otros serotipos tienen un número menor de copias.

De manera similar, se han utilizado genes no repetidos para tipificar cepas de Salmonella sp. y S. typhi, los cuales han incluido genes del flagelo (fli), de invasividad (inv), del antígeno capsular (via), del LPS (rfb), de antígenos de superficie (omp), de proteínas de estrés (groEL), o de islas de patogenicidad (SPI-1 y SPI-2). De hecho, estos estudios y la caracterización de la secuencia nucleotídica de éstos y otros genes, ha permitido determinar que las salmonellas pertenecen a un solo género, S. enterica, por su alto grado de conservación genética.

Organización del genoma

Una dirección electrónica en donde se puede consultar los avances recientes en la secuenciación y organización de los genomas de Salmonella es: elemento sin estilo url_web.

El paradigma de los genomas de bacterias entéricas es ciertamente el de la Escherichia coli K-12, bacteria comensal que convive con el ser humano. Actualmente, es el organismo mejor estudiado a nivel molecular, genético, bioquímico y fisiológico. Su genoma contiene más de 4.6 Mb, comprendiendo más de cuatro mil genes en un cromosoma circular. La secuencia nucleotídica se ha dividido en 100 segmentos o centisomas. que se distribuyen en orden creciente alrededor del cromosoma. Anteriormente, en lugar de centisomas se utilizaban minutos, que representaban el tiempo de la transferencia ordenada de los genes de una bacteria a otra, cuando el genoma se movilizaba por conjugación.

La estructura general del cromosoma y el orden génico están muy conservados entre Escherichia coli K-12 y S. typhimurium LT2, aunque con algunas diferencias. Hay segmentos presentes en una pero no en la otra bacteria y una inversión que abarca el 11% del genoma. De hecho, en general, todas las salmonellas mantienen el mismo orden génico que E. coli K-12, pero con inversiones de segmentos varios.

El genoma de S. typhi CT18 está constituido por un cromosoma circular de 4,809,036 pb, con un contenido de G+C de 52.09 %, más dos plásmidos: el pHCM1 de 218,160 pb, que codifica para resistencia múltiple a antibióticos, y pHCM2 de 106,516 pb, que es críptico o de función desconocida. Al igual que E. coli, contiene más de cuatro mil genes. S. typhi constituye una excepción a la conservación del orden cromosómico, porque presenta rearreglos mayores observados entre diferentes aislados clínicos. Existen inversiones y transposiciones de grandes segmentos, posiblemente promovidos por recombinación homóloga entre genes ribosomales (rrn), y no se observan pérdidas, inserciones, o duplicaciones de regiones cromosómicas. El significado biológico de estas particularidades en el genoma de S. typhi permanece un misterio y, ciertamente, será el tema de futuras investigaciones.

En general, parece haber menor conservación del orden cromosómico en cepas de Salmonella que infectan hospedantes específicos. Por ejemplo, el orden de los fragmentos grandes obtenidos con la enzima I-CeuI, y analizados por electroforesis de campos pulsados, es de ABCDEFG en S. typhimurium LT2, E. coli K-12, y en especies de Salmonella que crecen en diferentes hospedantes. Sin embargo, en S. typhi, S. paratyphi C, S. gallinarum, y S. pullorum, las cuales son hospedante-específicas (la última también para aves), estos fragmentos están rearreglados.

Otras variantes entre los genomas de las salmonellas incluyen la presencia o ausencia de diferentes islas de patogenicidad y de operones para fimbrias (descritos en las siguientes secciones). Asimismo, recientemente, se ha reforzado el concepto de la transferencia horizontal de genes de patogenia a través de fagos temperados, o virus bacterianos que pueden alojarse en el cromosoma de la bacteria, acarreando genes pasajeros de diferentes partes del genoma de otra bacteria.

La isla de patogenicidad-1 (SPI-1)

La SPI-1 fue el primer locus mayor de patogenicidad descrito para Salmonella. Fue encontrado en base a una propiedad fundamental, la invasividad. La idea inicial fue identificar una mutante natural de S. typhimurium que no invadiera células epiteliales en cultivo. Posteriormente, se clonó en un plásmido vector una mezcla de fragmentos del genoma de una cepa naturalmente invasiva (banco de genes), y se introdujo (complementó) a células de la mutante, identificando un fragmento que le confería la capacidad invasiva. Así se aisló un fragmento que contenía genes de invasividad, que fue denominado invCBA. Posteriormente, se realizó mutagénesis dirigida de este locus (o sitio del genoma) en la cepa silvestre invasiva, con transposones (fragmentos de ADN que se insertan en otro ADN causando su mutación), confirmando que, al hacerlo, se disminuía la capacidad invasiva.

Esta región ha sido extensamente estudiada y el número de genes en él contenida se ha extendido a 30. Se encuentra en el centisoma 63 y abarca 40 kb.

Así, los genes inv originales se han extendido a invJICBAEGFH, en donde la mayoría forman parte de un sistema de secreción tipo III, y donde las proteínas InvJ e InvH son secretados. Un sistema de secreción tipo III es, esencialmente, uno que se activa por contacto de la bacteria con las células hospedantes. Estos sistemas forman un puente de proteínas (pudiendo ser en forma de aguja), a través del cual atraviesan moléculas que ejercerán un efecto sobre la célula hospedante. De hecho, por ello, algunas de las proteínas del sistema de secreción tipo III forman parte de la membrana interna y otras son exportadas. También participan en la secreción los genes spaSRQPO (denominados así por su similitud con los genes de otra bacteria invasiva, Shigella) y los genes sipADCB ("salmonella invasion proteins"). El locus invC codifica para una ATPasa que aparentemente provee energía para el proceso; y sptP codifica para una fosfatasa que actúa sobre las tirosinas de proteínas de la célula hospedante ("salmonella protein tyrosine phosphatase"), alterando la transducción de señales. De manera global, la bacteria busca a través de éste y otros sistemas alterar la célula hospedante (por ejemplo, una célula epitelial) a fin de penetrarla (Animación 1): se ha observado, por ejemplo, que Salmonella causa un fenómeno de arrugamiento u oleaje (Animación 2), por desarreglos causados en el citoesqueleto; para después ser engullido (Animación 3) y empezar a multiplicarse en un compartimento vacuolar (Animación 4).

Curiosamente, el gen regulador hilA fue descubierto independientemente porque su sobre expresión confería capacidad hiperinvasiva a la Salmonella ("hyper invasive locus"). Se ha determinado que codifica para un regulador que activa los promotores para los genes inv y spa, sip y org ("oxygen-regulated gene"). El locus invF, a su vez, codifica para un regulador positivo para otros genes del locus. El locus sicA codifica para una proteína chaperona ("salmonella invasion chaperone"), que actúa en conjunción con la proteína reguladora InvF. Los genes prgKJIH ("PhoP repressed genes") son prendidos por la proteína HilA y apagados por la proteína reguladora PhoP, la cual también tiene un efecto regulador negativo sobre la expresión de hilA. La expresión de HilA, a su vez, es regulada positivamente por otro sistema regulador SirA/SirC.

De esta manera, una secuencia de eventos podría ser:

a) Las proteínas SirA y SirC promueven la transcripción de los locus hilC y hilD, produciéndose las proteínas HilC y HilD (Animación 5).

b) Las proteínas SirA, SirC, HilC y HilD se asocian a la ARN polimerasa para prender la transcripción de los genes orgA, prg y hilA (Animación 6).

c ) Las proteínas HilA y SirC se asocian a la ARN polimerasa para transcribir a partir de los operones inv y sip (Animación 7).

d) El aumento en la proteína PhoP inhibe la transcripción de los genes hilC y hilD, orgA y prg, y hilA, causando una disminución de la proteína activadora HilA (Animación 8).

e) El agotamiento de HilA causa el apagamiento de la transcripción en todo el sistema (Animación 9).

Este circuito ilustra cómo ha evolucionado un sistema de prendido y apagado de genes en bacterias; y nos da la idea de cuán complejo pueden ser los procesos de virulencia en Salmonella, sobre todo si consideramos que hay muchos otros genes involucrados en patogénesis.

El sistema PhoP/PhoQ

El papel de este sistema en la virulencia se estableció, por primera vez, cuando se probó la capacidad infectiva de diversas mutantes en genes de reguladores ya caracterizados. Se encontró que una mutante en phoPQ causaba una disminución considerable en la virulencia, cuando la Salmonella era inyectada intraperitonealmente. Es decir, la dosis letal media (LD50), o la cantidad de bacterias de la mutante requerida para matar a la mitad de una población de ratones de laboratorio, era mucho mayor que la que se requería de la silvestre. El locus phoP/phoQ había sido descrito con anterioridad por su capacidad de regular una fosfatasa ácida; de ahí el prefijo pho (del inglés "phosphatase"), que curiosamente no se regulaba por la presencia de cantidades bajas de fosfato, por lo que se le considera una fosfatasa no-específica cuyo papel en la fisiología de la bacteria es desconocido. Esta historia ilustra como la investigación básica, a través de la descripción de lo desconocido, sin otro propósito, sirvió de base para avanzar más rápidamente en una pregunta central de patogénesis bacteriana.

Este es un sistema de dos componentes, en donde PhoP regula la expresión de varios genes en el citoplasma, es decir, tiene un efecto pleiotrópico. Algunos son apagados, los prg, como los descritos en la sección anterior, y otros son activados, los pag ("PhoP activated genes"). PhoP a su vez es activada por la fosforilación proveniente de PhoQ, una proteína de membrana interna que percibe señales del exterior. Una de las señales es la baja concentración del ión magnesio, la cual causa un cambio conformacional en PhoQ con la consecuente fosforilación de una histidina de PhoP a partir del ATP (actividad de histidina cinasa). Más aún, se ha observado que este sistema se activa dentro de las vacuolas del macrófago, en donde residen las salmonellas. Es así que se postula que la bacteria mantiene prendidos los genes prg antes de invadir los macrófagos, y por ello tienen un papel en este estadio; para después apagarlos en cuanto se prende el sistema y, por consecuencia, activar a los genes pag que tendrían un papel en los estadios tardíos de la invasión.

Otros loci de patogénesis

Se han descrito otras cuatro islas de patogenicidad en S. typhimurium. SPI-2 se encuentra en el centisoma 31, media la sobrevivencia en el macrófago e infección sistémica, y codifica para un sistema de secreción tipo III. También se ha visto que mutantes en el gen del regulador global OmpR de S. typhimurium, se ven afectadas en la capacidad citotóxica hacia el macrófago y muestran una virulencia disminuida hacia el ratón. También se han aislado varias decenas de mutantes que afectan la sobrevivencia de S. typhimurium dentro del macrófago (ims de "intramacrophage survival"), algunas de las cuales han revelado loci de función desconocida y otras mapean en genes de funciones básicas de la célula, como enzimas para la síntesis de purinas o aminoácidos aromáticos que la bacteria requiere en el ambiente intracelular.

Se ha observado la presencia de varios operones o grupos de genes que codifican para fimbrias, o estructuras proteicas en forma de espinas que se proyectan hacia el exterior, que permiten a la bacteria adherirse a diferentes superficies incluyendo células del hospedante. S. typhi contiene una porción de estos operones como los lpf (de "long polar fimbriae"), los fim y agf. Otros operones fimbriales están presentes en serotipos de Salmonella frecuentemente aislados de animales domésticos.

El gen para el factor sigma RpoS, que estimula a la ARN polimerasa para transcribir genes en la fase tardía de crecimiento o estacionaria, se encuentra mutado en varias cepas avirulentas de S. typhimurium, revelándose así su papel en patogénesis. Curiosamente, la cepa vacunal Ty21a tiene una mutación en rpoS, aunque no es claro si es la única mutación que determina su atenuación.

Genes expresados in vivo: ¿qué es un factor de virulencia?

Se han diseñado estrategias elegantes para conocer qué genes de S. typhimurium son expresados in vivo, es decir durante la infección del ratón. Una estrategia se denomina "Tecnología de Expresión In vivo", o IVET de las siglas en inglés, en donde se hace uso del gen purA, el cual es esencial para sobrevivir en el hospedante. De esta manera, se insertaron frente a un gen purA, carente de región reguladora y presente en un plásmido, fragmentos al azar del genoma de S. typhimurium, permitiéndose la incorporación de estas construcciones en el genoma de una cepa donde previamente se había mutado el gen purA nativo. La colección de bacterias, conteniendo la gama de fragmentos frente a purA, se aplicó a los ratones por vía oral y se aislaron bacterias sobrevivientes en el bazo. Estas bacterias sobrevivieron gracias a que se insertó enfrente del gen purA, un segmento de ADN que promovía su expresión in vivo. De esta manera, se identificaron los genes correspondientes. Entre los primeros cinco loci (o grupos definidos de genes) identificados, hubo tres para funciones básicas de la célula, a saber:

a) para el operón carAB que codifica para dos subunidades de la carbamoil fosfato sintetasa, involucrada en la síntesis de un aminoácido (arginina);

b) para el operón pheSThimA, que codifica para dos subunidades de una enzima involucrada en la síntesis de proteínas (fenilalanina-tRNA sintetasa) y una subunidad de IHF, una proteína reguladora que se une y cambia la conformación del ADN, influyendo sobre la síntesis o replicación, la regulación genética y la recombinación;

c) y otro gen opuesto a los genes para el antígeno O.

En estudios posteriores, se ha logrado tener una colección de más de veinte genes ivi (de "in vivo-induced") de S. typhimurium, de los cuales la mayoría corresponden a funciones metabólicas, mientras otros son reguladores o bien genes regulados por RpoS. Estudios similares en Vibrio cholerae han dado resultados semejantes.

Estas observaciones han causado el resurgimiento de una pregunta fundamental en el área de patogenia bacteriana: ¿qué constituye un factor de virulencia? Esta pregunta surge porque no parece haber un claro límite entre genes que codifican para factores que sólo son relevantes en procesos de virulencia y otros que lo son para funciones metabólicas básicas, aparentemente no relacionadas a la virulencia. Conceptualmente no es difícil imaginar que la gran mayoría de los genes participa en los procesos de adaptación a diversos entornos, tanto del hospedante como externos, en vista de que la Salmonella sólo cuenta con poco más de cuatro mil genes. Pudiera ser que la modulación de la respuesta a diferentes microambientes se dé a través de variaciones en la concentración de las proteínas de la célula bacteriana, lo que ocasionaría cambios sutiles en las interacciones entre ellas.

Otra estrategia ha sido la de mutagénesis etiquetada por secuencia (o "sequence tag mutagénesis"). En este esquema, es posible generar mutantes con transposones etiquetados con una secuencia nucleotídica específica, para poder identificar por hibridación las mutantes que fueron ingeridas por los ratones y aquéllas que fueron recuperadas del bazo. Es por este análisis que se puede determinar qué mutantes no sobrevivieron hasta el bazo y que, por tanto, se encuentran en genes necesarios para la sobrevivencia in vivo.

La metodología no sólo ha sido aplicada a S. typhimurium, sino a otras bacterias de interés médico como V. cholerae, Yersinia enterocolitica, Staphylococcus aureus, y Streptococcus pneumoniae, agentes causales del cólera, la peste, e infecciones del tracto respiratorio, respectivamente. Interesantemente, la conclusión general es la misma que con el IVET: no es posible delimitar claramente entre genes que sólo participan en la virulencia y otros que no lo hacen. Es más, los genes identificados en S. typhimurium no concuerdan con los obtenidos por el IVET, lo que ilustra las limitaciones y restricciones de cada estrategia experimental.

Epílogo

El estudio de bacterias patógenas ofrece una pléyade de preguntas emocionantes sin resolver, cuya solución nos permitirá conocer mejor no sólo los procesos fisiológicos de los microorganismos con los que convivimos, sino también nuestras propias formas de respuesta para evolucionar y sobrevivir en este entorno. Y, de esta manera, surgirán nuevos conceptos que nos deben conducir a formas novedosas de resolver problemas de salud pública que aquejan, sobre todo, a los segmentos de la población humana menos favorecida.