Luis Kameyama, Norma Oviedo y Gabriel Guarneros.

Departamento de Genética y Biología Molecular, CINVESTAV-Instituto Politécnico Nacional

Introducción

El estudio de las bacterias estaría incompleto sin el estudio de sus elementos extra-cromosomales como son los plásmidos y sus virus (bacteriófagos ó fagos). Estos elementos son autónomos ya que pueden replicarse por si solos, portan información genética y pueden conferirle a la bacteria nuevas propiedades. Los bacteriófagos al igual que las bacterias, pueden encontrarse en casi todos los lugares, pero se presentarán generalmente donde estén sus huéspedes obligatorios.

Los fagos pueden clasificarse de acuerdo a su desarrollo en dos grupos: los fagos virulentos y los fagos temperados. El desarrollo de los fagos virulentos se inicia infectando a la bacteria, posteriormente sus genes son transcritos y traducidos para producir sus propias proteínas, las cuales son necesarias para la replicación de su genoma, para la formación de su cápside y tallo, para el empaquetamiento del nuevo material genético sintetizado y para la lisis bacteriana, y teniendo como objetivo final la producción de las partículas o viriones maduros. Los fagos temperados pueden seguir al igual que los fagos virulentos la vía lítica, pero a diferencia de éstos, pueden convivir como profagos dentro de la bacteria. A la bacteria que posee un fago integrado se le denomina bacteria lisógena, y al fago integrado se le denomina profago. En la vía lisogénica, como en el caso del bacteriófago λ (lambda) que infecta a su huésped Escherichia coli, su ADN inyectado en forma lineal es primeramente circularizado para ser posteriormente integrado al cromosoma bacteriano. El ADN de λ integrado estará formando parte del cromosoma bacteriano. La replicación del ADN se lleva en forma pasiva, o sea, solo se replicará si se replica la del cromosoma del huésped. Las funciones para que se desarrolle la vía lítica estarán reprimidas y por consiguiente permanecerá en un estado de latencia. Este estado puede continuar a través de un número indefinido de generaciones, hasta que algún disturbio ambiental induzca la señal para que el ADN se escinda. Las funciones líticas se verán reactivadas y se producirán nuevos viriones (Fig. 1).

El bacteriófago λ se caracteriza por estar constituida aproximadamente de la mitad de proteína y la otra mitad de ADN. Su cromosoma la forma una molécula de ADN de doble cadena y consta de 48,502 pb, conteniendo aproximadamente 50 genes, que codifican para 5 proteínas relacionadas con la regulación, 7 con la recombinación, 21 con la morfogénesis de la cápside y tallo, 2 con la replicación y 2 con la lisis bacteriana. El genoma del fago λ está organizado de tal forma que presenta grupo de genes en unidades funcionales. A la derecha del sitio attP (sitio de integración del fago), se localizan los genes relacionados con la recombinación, posteriormente los genes relacionados a la regulación, le siguen los de replicación, los de lisis y finalmente los genes relacionados para la formación de la cápside y del tallo (Fig. 2). La cápside tiene una estructura icosaédrica, con un diámetro aproximado de 0.05 μ, y unido a ésta, una proyección tubular de 0.15 μ de longitud.

Lambda fue descubierto por Esther Lederberg en 1951, y a partir de su descubrimiento el estudio con el fago λ sigue siendo un factor importante en la contribución al conocimiento de la Genética Molecular.

En este capítulo, nos enfocaremos en la descripción del desarrollo del fago λ, iniciando con la infección fágica, y el control de la regulación de la expresión de genes necesarios para su desarrollo lítico o lisogénico, continuaremos con el establecimiento y mantenimiento de la represión. Posteriormente describiremos la recombinación integrativa y las diferentes formas de replicación, terminaremos con el ensamblaje de la cápside, empaquetamiento del ADN y la lisis celular.

Infección

La infección es realizada básicamente en dos etapas, la adsorción y la inyección del ADN. La adsorción es reversible a bajas temperaturas, pero resulta irreversible una vez que el ADN ha sido inyectado. Lambda infecta eficientemente a la temperatura de 37°C. El proceso de la infección requiere de energía metabólica del huésped. El producto del gen J del fago λ, el cual está formando parte del extremo distal del tallo de λ reconoce al receptor de maltosa LamB ubicado en la membrana externa del huésped. La inyección eficiente del ADN requiere además el producto del gen pstM, proteína relacionada en el transporte de fosfato y ubicada en la membrana interna. Se ha observado que la infección por λ ocurre sin cambios contráctiles en la estructura del tallo, a diferencia de lo que sucede con el fago T4. Una vez que el ADN ha penetrado a la célula, es circularizado por unión de sus extremos cohesivos en los sitios cos (regiones de cadena sencilla de ADN de 12 nucleótidos y cuyas secuencias se complementan). Posteriormente los extremos del ADN son unidos en forma covalente por la ligasa del huésped.

Desarrollo lítico del fago lambda

Después de la infección, λ puede desarrollarse en forma lítica o lisogénica, seleccionando funciones para cualquiera de estas dos vías. Si λ opta por el desarrollo lítico requerirá de la expresión concertada de varias funciones, producto de genes virales y del huésped, y las funciones propias de la lisogenia serán reprimidas, así el fago λ seguirá un estricto plan de desarrollo.

El programa lítico empieza con la iniciación simultánea de la transcripción de dos promotores: el izquierdo pL y el derecho pR. El transcrito temprano de pL termina en el terminador de la transcripción tL1 y produce un transcrito de ~1,000 nts, equivalente a un ARNm 12S. El transcrito del promotor pR termina en tR1 y produce un ARNm equivalente de 9S. El transcrito temprano de pL contiene al gen N y cuyo producto N suprime los terminadores de la transcripción. El transcrito temprano de pR contiene al gen cro, y su producto es un represor transcripcional que regula negativamente la síntesis del represor CI, así como de los transcritos de pL y pR (Fig. 2).

Transcripción temprana-tardía

La proteína N modifica a la ARN polimerasa que transcribe a partir del promotor pL. Esta desconoce a los terminadores de la transcripción tL1, tL2, y a otros más localizados en el operón izquierdo, produciendo transcritos >7,000 nts que incluyen la región b, más allá del sitio attP (Fig. 3). El mensajero a partir del promotor pR termina ~50% en tR1. La proteína N, modifica a la ARN polimerasa y transcribe eficientemente los genes cII, O, P y Q (Fig. 3). Entre los genes P y Q se encuentra un segundo terminador tR2. Este terminador es mucho más eficiente que tR1 y solamente es suprimido por la presencia de N. Así, la ausencia de N, no permite que Q sea expresada. Sin embargo, fagos con deleciones en tR2 (λ nin), pueden parcialmente, propagarse en forma lítica aún en ausencia de la proteína N.

Se ha observado que varios minutos después de la infección, la síntesis de los genes tempranos (N y cro), así como de los genes tempranos tardíos (del lado derecho cII, O, P; del lado izquierdo cII, gam, beta, etc.), empieza a disminuir por la inhibición de la transcripción de pL y pR. Esto es debido a que la proteína Cro se une a los operadores oL y oR, que se traslapan con sus respectivos promotores pL y pR. La inhibición debida a Cro resulta esencial para el programa lítico, ya que una excesiva actividad de pL, así como de pR puede ser letal para el desarrollo de λ. Se ha observado que la sobreproducción de varios productos de λ produce efectos adversos en el metabolismo de huésped, así como del fago.

Transcripción tardía

La siguiente etapa, en la expresión de los genes tardíos de λ se requiere del producto del gen Q, el cual actúa como un antiterminador para la transcripción de pR´. Este promotor esta localizado entre el gen Q y el gen R. La transcripción de pR´ es constitutiva. El ARNm 6S producido corresponde a la región del inicio de la transcripción sR´ al terminador tR´. Este transcrito es detectado aún en una lisógena reprimida. Así, el transcrito de pR´ por la acción de Q se extiende a través de los genes tardíos que en su mayoría codifican para las proteínas estructurales, y termina en algún lugar de la región b (Fig. 3).

Regulación del programa Lítico

Mecanismo de acción de N

El producto del gen N es una proteína de ~12,200 daltones, que activa la expresión de los genes de λ, antagonizando con la función de los terminadores de la transcripción. Se ha observado que solamente los transcritos originados de los promotores pL y pR son susceptibles de ser antiterminados por la acción de la proteína N. Salstrom y Szbalski en 1978 reportaron una región en el operón pL necesario para que se llevara la antiterminación, y la denominaron nut (esta región esta compuesta a su vez por dos sitios: boxA y boxB), localizado entre el promotor pL y el terminador tL1. Mutaciones en este sitio, aún en presencia de N, provocan que la transcripción termine en tL1. Posteriores estudios ubicaron a esta región en los primeros 70 pb con relación al inicio de la transcripción de sL. El análisis por secuencia reveló que las mutaciones que no eran capaces de antiterminar caían en una región de simetría de repetidos invertidos y que forman una estructura de horquilla (boxB), por el apareamiento de sus bases. En forma similar, para el operón de pR se identificó una secuencia muy parecida a boxB de nutL, de unos 16-17 pb entre el carboxilo terminal del gen cro y el terminador tR1. Este sitio fue denominado boxB, que junto con boxA de nutR, constituyeron la región necesaria para la realización de la antiterminación.

Por otro lado, se ha demostrado que se requieren factores del huésped para que la actividad de la proteína N sea efectiva. A estos factores se les denominó Nus. Se seleccionaron mutantes de E. coli incapaces de crecer λ pero que invariablemente permitieron el crecimiento de fagos λ nin (independientes de N). Las mutantes llamadas nus ó nus^- fueron localizados en cinco genes: nusA, nusB, nusC, nusD (rho) y nusE, e ubicados en el genoma de E. coli en los minutos: 69, 11, 88, 84 y 72, respectivamente. Posteriormente se encontró a otro gen nusG, cuyo producto está involucrado en la antiterminación.

El modelo que explica la intervención de N para que realice su función antiterminadora es ciertamente complejo. Se forma un complejo comprendiendo a la ARN polimerasa, los factores del huésped (NusA, NusB, NusE y NusG), así como N del fago y el sitio nut del ARNm. La parte amino terminal de la proteína N hasta el residuo 19 reconoce a la caja B de nut, la región comprendida entre los aminoácidos 34 a 47 interacciona con el factor NusA, y la parte carboxilo terminal de los residuos 73 a la 107 reconoce a la ARN polimerasa. El factor NusA al igual que la proteína N, reconocen las dos cajas A y B de nut e interacciona a su vez con la ARN polimerasa. Menos estudiadas son las interacciones de los factores NusB y NusE (equivalente a la proteína ribosomal S10), pero ambas son capaces de reconocer a la caja A. Adicionalmente ambos factores interaccionan directamente con la ARN polimerasa. La proteína NusG, interacciona con la ARN polimerasa y con NusD (equivalente al factor r de la terminación). Así este complejo transcribe y desconoce los terminadores de la transcripción (Fig. 4). Adicionalmente, el complejo permanece unido al sitio nut del ARNm formando un ARN en forma de asa que crece a medida que avanza la ARN polimerasa.

La proteína Q y su función

La expresión de los genes tardíos requiere de la función antiterminadora de la transcripción de la proteína Q. El producto de los genes R y S son los primeros en transcribirse a partir del promotor pR' y están relacionados con la lisis bacteriana. El producto de 10 genes que se transcriben posterior a R y S se relacionan con el ensamblaje de la cápside, y el producto de 12 genes posterior a los genes que codifican para la estructura de la cápside se relacionan con el ensamblaje del tallo.

El producto del gen Q es una proteína de ~22,500 daltones. El mecanismo por la cual antitermina es diferente al de N. La proteína Q actúa sobre el ADN en un sitio denominado qut el cual está localizado entre la posición -10 y -35 del promotor pR´. La unión de Q a qut ocurre mientras esté presente el factor de iniciación σ⁷⁰ en la ARN polimerasa, ya que es necesario un cambio conformacional del templado de cerrado a abierto en el complejo de iniciación. Para que Q actúe se necesita que la ARN polimerasa haya iniciado la transcripción, y haga una pausa alrededor de los nucleótidos +16 y +17. Sin embargo, una doble mutación en -15 y -13 de la secuencia del promotor reduce la antiterminación por Q alrededor de unas 10 veces sin cambiar la pausa en +16/+17. La región posterior al inicio de la transcripción es también necesaria ya que mutaciones en +2 y +6, impiden la acción por Q, y eliminan o reducen sustancialmente la pausa inicial. Al parecer, el único factor del huésped necesario para la antiterminación por Q es NusA, ya que estimula la actividad de la ARN polimerasa en una forma considerable sobre los terminadores de la transcripción. Este transcrito tardío es sintetizado en forma continua y se extiende alrededor de unos 26 kb.

El hecho de que λ utilice otro regulador positivo Q, en adición a N, para llevar a cabo su desarrollo lítico, pudiera explicarse en la fuerza de estos activadores. Estudios de la medición de la vida media del ARNm indican que la región tardía es uniformemente transcrita. En contraste con la de pL, bajo la influencia de N, disminuye rápidamente con la distancia.

Establecimiento y Mantenimiento de la Represión

Si después de la infección, el fago λ opta por la vía lisogénica, deberá integrarse al cromosoma bacteriano y habrá de mantener reprimidos los promotores pL y pR. En el estado lisogénico el sistema de represión está funcionalmente activo manteniendo constantes los niveles del represor CI mientras no exista algún disturbio que active el desarrollo lítico.

El represor CI es sintetizado a partir de los mensajeros de dos promotores diferentes: pRE y pRM. Ambos promotores tienen como función principal la de transcribir al gen cI, pero actúan a diferentes tiempos en la vía lisogénica.

Para que el estado lisogénico inicie después de la infección, se requiere de la transcripción del promotor pRE. Este promotor está localizado ~400 pb a la derecha del gen cI, y se solapa con la región 5'terminal del gen cII. La transcripción de pRE es en contrasentido al del promotor pR y requiere del activador CII. Una vez iniciada la transcripción del promotor pRE, estos transcritos en contrasentido a los de pR pueden complementarse y unirse con los de pR formando una doble hélice de ARN. Esta estructura deberá inhibir la expresión de Cro, así como la de CII. La inhibición de Cro es fácilmente entendible, ya que esta proteína actúa en forma antagónica al represor CI. Para el proceso lisogénico se requiere que los niveles de Cro estén en su mínima expresión. Sin embargo, resulta más difícil entender la disminución de la expresión de CII, ya que ésta es requerida para la producción de CI. Es probable que en el momento en que CII activa al promotor pRE, los niveles de CII en la célula están lo suficientemente altos, y no requiera de una síntesis adicional de CII para establecer la lisogenia. Adicionalmente, cabe mencionar que el transcrito proveniente de pRE que transcribe al gen cI tiene un Shine Dalgarno lo bastante fuerte para que CI sea traducido en forma eficiente. El regulador positivo CII también actúa sobre el promotor pI que transcribe al gen int, y cuyo producto es necesario para que el cromosoma de λ se integre al cromosoma bacteriano. Los niveles de la proteína CII en la célula deben estar lo suficientemente altos para activar a pRE y a pI. Debido a que CII es metabólicamente inestable y es degradada fácilmente por la acción de la proteasa HflA del huésped, se requiere un factor adicional del fago, la proteína CIII, que contrarresta la acción de esta proteasa. Así, CIII junto con CII son requeridos para que se lleve una eficientemente lisogenización. Sin embargo, CIII no será necesario si el huésped contiene un gen hflA inactivo (Fig. 5).

Mantenimiento de la Represión

El mantenimiento del estado lisogénico es debido a la acción del represor CI, producido de la transcripción del promotor pRM. Este promotor requiere de la acción del mismo represor CI para activarse. El promotor pRM se solapa con uno de los sitios de la región del operador O_R, el sitio O_R3. Para el mantenimiento de la represión se requiere primeramente que el represor CI actúe impidiendo la transcripción de los promotores pL y pR, por medio de una unión en forma homodímera de CI, sobre el lado derecho en los sitios O_R1 y O_R2 (los cuales se solapan con el promotor pR), y del lado izquierdo a los sitios O_L1 y O_L2 (que se solapan con el promotor pL). El dímero de CI se une preferentemente a la región O_R1 del lado derecho, y a O_L1 del lado izquierdo. Estas uniones permiten que de manera cooperativa el siguiente homodímero de CI se una a O_R2 y O_L2, respectivamente. Concentraciones "normales" del represor en la célula, permiten que los sitios O_R1 y O_R2 estén ocupados generalmente, y esta interacción no se extienda al sitio O_R3. Mutaciones en el sitio O_R1, hacen que el dímero se una a los sitios O_R2 y O_R3, indicando que la unión es cooperativa entre los dímeros de los represores. La unión del represor al sitio O_R2 permite que la ARN polimerasa unida al promotor pRM, se active y transcriba al gen cI, produciéndose más represor. Si las concentraciones de CI siguen en aumento, el promotor pRM se apagará debido a que el represor se une al sitio O_R3. Este sitio y parte del sitio O_R2 se solapan con el promotor pRM. Después de un cierto tiempo, el represor decae, su concentración baja y el sitio O_R3 es el primero en quedar libre por tener menor afinidad. Los otros sitios O_R2 y O_R1 quedarían libres, sino fuera porque el represor CI unido a OR2 es capaz de activar nuevamente a la ARN polimerasa de pRM. De esta manera se autorregula la expresión de CI, manteniendo constantes los niveles de CI en el citoplasma (Fig. 6). El represor CI es mantenido en ~200 copias por célula y no sólo impide la transcripción de genes del profago, sino también la transcripción de otros genes de fagos infectantes homólogos, por la unión del represor CI a las regiones operadoras O_L y O_R del fago(s) infectante. Este mecanismo en la que una bacteria lisógena es capaz de inhibir la infección por un fago homólogo (fago con la misma especificidad del represor) es denominado inmunidad. Así, el represor CI es específico para fagos que tienen la misma región de inmunidad.

Integración y Escisión del profago λ

El ADN del fago entra a la célula en forma lineal pero enseguida se circulariza por complementación de los extremos cohesivos y ligación de los "nicks" correspondientes. En la respuesta lisogénica las funciones líticas, inclusive la replicación, están reprimidas por lo que, cuando la bacteria se divide, el ADN circular del fago λ podría ser segregado desigualmente entre la progenie. Este evento se evita por la integración del ADN de λ al genoma de la bacteria, en forma que al replicarse el profago se transmite igualmente a las células hijas.

La integración se efectúa por un evento de recombinación sitio-específica mediado por la integrasa (Int) codificada por λ y por proteínas del huésped llamadas factores de integración (IHF). Cuando se levanta la represión de una lisógena se requiere que el profago se escinda del cromosoma bacteriano. La escisión requiere también de Int y de los IHF, pero además necesita Xis, el producto del gen xis adyacente a la derecha de int.

Expresión de Int durante la lisis

La transcripción del mensaje policistrónico a partir de pL es afectada por la acción de la proteína antiterminadora N (ver arriba). El ARN contiene, entre otros, los mensajes de xis e int, pero además contiene la región sib (por sitio inhibidor de la región b) responsable del control postranscripcional de int llamado retroregulación. La región sib se localiza a la izquierda del gen int distal al sitio attP, donde se efectúa la recombinación integrativa, y reduce la síntesis de proteína Int. El ARNm que contiene la región retroreguladora sib forma una estructura de tallo y asa que es procesada por la RNasa III. El extremo 3´ generado es susceptible a la degradación por PNPasa y RNasa II. Estas enzimas son exonucleasas que degradan el ARN progresivamente en dirección 3´ a 5´, lo cual implica que el mensajero de int sea eliminado. No suceden así con el gen xis en el extremo 5´ del mismo transcrito porque dentro del mensaje de int se forma una estructura secundaria que resiste la acción de las exonucleasas. Este evento explica que no se sintetice suficiente proteína Int a partir del ARNm originado en pL para poder integrar el ADN del fago (Fig. 7). La proteína Int no es necesaria si la bacteria infectada está comprometida a una respuesta lítica.

Expresión de int durante el establecimiento de la lisogenia

Cuando después de la infección por λ la concentración de CII alcanza niveles relativamente altos en la célula, se favorece la ruta lisogénica. La proteína CII estimula la transcripción en los promotores pRE y pI que está asociada con el establecimiento de la lisogenia. La transcripción a partir de pRE permite la síntesis del represor de la lisogenia CI y a partir de pI se expresa Int, la proteína que media la integración. Ya que el inicio de la transcripción de pI ocurre dentro del gen xis, que precede a int, el ARNm generado se traduce en Int pero no Xis. La transcripción a partir de pI se detiene en el terminador tI una estructura de tallo y asa que está contenida pero no es idéntica a la estructura sib mencionada antes. El de pI es un mensajero que sólo contiene int que es estable debido a la estructura del terminador tI y que se traduce eficientemente en la Integrasa.

Recombinación sitio especifica de λ

Los sitios donde se lleva a cabo la recombinación integrativa son attP en el ADN del fago y attB entre los operones gal y bio del cromosoma bacteriano. Estos sitios mantienen homología limitada a unos 30 pb. Ya que las recombinaciones generales de la bacteria o la del fago, requieren de homología en las secuencias de cientos de pares de bases de ADN, es claro que la integración requiere de otro sistema. Este sistema se le ha llamado "recombinación sitio específica" y se caracteriza por su alto grado de especificidad y direccionalidad.

El sitio de recombinación attP del fago, además de un núcleo de 15 pb, involucra otras secuencias adyacentes (150 pb a la izquierda y 78 pb a la derecha); asimismo attB consta de un núcleo de 15 pb de secuencia idéntica a la de attP y secuencias adyacentes que son parcialmente homólogas a la secuencia de λ. La recombinación entre ambos sitios att se lleva a cabo gracias a la participación de la integrasa del fago y las proteínas IHF del huésped. La recombinación se efectúa por un mecanismo de corte y reunión en el núcleo común. El símbolo de la región común es O y está flanqueado por los brazos o regiones adyacentes simbolizadas P y P´ que representan los brazos izquierdo y derecho de attP. B y B´ simbolizan las regiones correspondientes de attB. Las reacciones de inserción y escisión se acostumbran abreviar por la siguiente ecuación:

Int IHF termosensible

POP´ (attP) + BOB´ (attB) <— —> BOP´ (attL) + POB´(attR)

Int, Xis, IHF termoestable

Las secuencias attL y attR son productos de la recombinación integrativa y sustratos para la escisión. La proteína integrasa participa en ambos procesos, y es esencial para la integración ya que requiere de una mayor concentración de int, mientras que la escisión ocurre cuando hay una mayor concentración de Xis que de Int.

Formación del intasoma

La integrasa es un polipéptido de ~40,000 daltones, con funciones de recombinasa, unión especifica al ADN de attP y de topoisomerasa. Esta enzima es capaz de cortar y ligar las cadenas de ADN para relajar su estructura y promover el intercambio de cadenas con el ADN de la bacteria. La proteína Int se une al ADN formando multímeros consistentes de 4 a 8 monómeros al núcleo de attP (donde el entrecruzamiento de cadenas ocurre) reconociendo un par de secuencias de invertidas repetidas que se encuentran uniendo al núcleo y a los brazos flanqueadores del attP.

Int también se une a una sequencia que se repite 5 veces en los brazos de attP. La proteína IHF de E. coli tiene tres sitios de unión en los brazos de attP. Bajo la influencia del superenrollamiento del ADN, attP, Int y IHF, se forma una estructura superenrollada denominada intasoma que es la especie activa de la recombinación integrativa. En contraste el sitio attB, es sencillo y no contiene secuencias de unión para IHF como los brazos de attP, tampoco es necesario el superenrollamiento en esta región del ADN para la recombinación. La región attB tiene la misma secuencia de 15 pb que se halla en el núcleo del attP y algunos pares de bases que le flanquean completan el par de sitios de unión para Int (Fig. 8). A estos sitios de unión en attB se unirán las proteínas Int que forman parte del intasoma y no así la proteína Int presente en el citoplasma.

El modelo de recombinación integrativa postula la formación de una estructura sináptica entre las cuatro cadenas de ADN en sus regiones homólogas. El acercamiento de las cuatro cadenas auxiliadas por el intasoma permite que ocurra el corte en uno de los extremos del núcleo de las regiones att, las dos cadenas con la misma polaridad son cortadas, ocurre la rotación de estas cadenas alrededor de las que no han sido cortadas que permite alinearlas con las nuevas cadenas compañeras para ser finalmente ligadas a estas.

Este primer intercambio de cadenas tiene la topología de una estructura de Holliday. Para resolver el entrecruzamiento de las cadenas remanentes, estas son cortadas en el otro extremo del núcleo, rotan y son religadas a las nuevas cadenas correspondientes. Para esta reacción la presencia de IHF no es necesaria y la proteína Int la puede llevar a cabo. En cambio para el primer entrecruzamiento de cadenas si es necesaria la presencia de IHF.

La escisión del profago

La escisión del ADN del fago requiere de las proteínas Int y Xis. Los genes int y xis se localizan juntos inmediatamente a la derecha del sitio attP. Las secuencias de estos genes tienen una superposición de 20 pb. entre el extremo 5´de int y el 3´de xis.

Cuando se induce la fase lítica se requiere la escisión del ADN del fago. La inactivación del represor CI producida por la proteasa RecA permite la transcripción a partir de pL para producir un ARNm que contiene al gen xis e int, pero no la región sib que fue separada físicamente durante la recombinación del sitio attP con attB. Este transcrito no será degradado y permite la traducción de ambos genes eficientemente, y cuyos productos son necesarios para la escisión (Fig. 8).

La escisión es de tipo sitio especifica y requiere de Int, Xis e IHF. Para esto las cadenas con los sitios attL y attR son intercambiadas para restaurar los sitios attP y attB. La escisión requiere de Xis la cual tiene 2 sitios de unión en el attR. Se piensa que Xis estabiliza la unión de Int para promover un nuevo evento de recombinación entre attR y attL. La reacción de escisión es resistente a la temperatura a diferencia de la integración que es inhibida por la temperatura y altas concentraciones de Xis.

Replicación del fago λ

La replicación del ADN del fago λ puede llevarse a cabo en forma pasiva o en forma activa. La replicación en forma pasiva es realizada por la replicación del cromosoma bacteriano, ya que el ADN de λ esta integrado, y al replicarse el cromosoma bacteriano, se replica también el de λ. La replicación activa es independiente de la replicación del cromosoma del huésped. Esta es llevada a cabo en dos fases: la temprana y la tardía. En la fase temprana, la replicación es iniciada a partir de un único origen. Es realizada en forma bi-direccional generando moléculas de ADN circulares. La replicación sigue la forma Θ por la semejanza de las estructuras intermedias con la letra griega Tetha. En la fase tardía de la infección, la replicación sigue la forma del circulo rodante (s), generando múltiples moléculas lineales de ADN de l (Fig. 10).

Para que se lleve a cabo la replicación, se requiere de la maquinaria replicativa, la cual consta de un gran número de proteínas, y de las cuales la mayoría provienen del huésped. Solamente dos proteínas fágicas, codificadas por el producto de los genes O y P, participan directamente en la iniciación de la replicación. Así, la replicación posterior a su inicio sigue el mecanismo establecido del huésped E. coli. La mayoría de las proteínas implicadas en la replicación, fueron identificada retando al fago λ a replicarse bajo las condiciones no permisivas de temperatura en cepas mutantes termo-sensibles para la replicación de E. coli.

Replicación Temprana

Posterior a la inyección de la molécula lineal del ADN de λ, esta es convertida a una molécula circular covalentemente cerrada por apareamiento de sus extremos cohesivos de 12 nts (sitios cos) y su posterior ligación (Fig. 10). Esta molécula circular por la acción de la ADN girasa se superenrolla negativamente formando el sustrato replicativo.

Se ha observado bajo el microscopio electrónico que la mayoría de las moléculas tienen la forma de Θ en el estadio replicativo temprano. Estas estructuras presentan dos cadenas de la misma longitud, correspondiente a la región replicada, y unido a sus extremos, un tercer segmento el cual no ha sido replicado. Adicionalmente, se observa que existe un pequeño porcentaje de círculos con una pequeña hebra unida a ésta, indicando que la replicación también sigue el modelo del círculo rodante.

La replicación empieza en un origen único y procede bidireccionalmente. Las asas replicativas, donde se lleva a cabo la síntesis del ADN, se mueven en forma divergente a su origen y progresan a través del círculo con velocidades muy similares.

La reiniciación en el origen, está regulada y normalmente no ocurre, hasta que el ciclo replicativo se haya completado. Sin embargo, se ha observado que bajo ciertas condiciones, como la adición de cafeína 2mM al medio, es posible la reiniciación, observándose que ~20% de las moléculas han reiniciado, aún cuando el ciclo replicativo anterior no haya finalizado. Se propone que la droga actúa bajando la estabilidad helicoidal del ADN, o sea cambiando la estructura del templado y facilitando por consiguiente la reiniciación de la replicación.

Ambas cadenas del ADN parental son copiadas, de acuerdo al modelo replicativo Θ. Sin embargo, una observación más cuidadosa de las microfotografías electrónicas de alta resolución revelan que en varias de las estructuras q, en la posición de las asas replicativas, o sea, en los inicios de la síntesis del ADN, se presentan pequeñas regiones de ADN de cadena sencilla. Estas regiones pueden ser observadas en ambas asas y estando siempre en el inicio y en brazos opuestos. Esta asimetría inherente en la progresión de las asas replicativas y sabiendo que la ADN-polimerasa lleva a cabo siempre su síntesis en dirección 5´ a 3´, y que la constitución de la doble hélice es antiparalela, puede explicarse que una de las cadenas es replicada en forma continua y la otra en forma discontinua. La longitud de estas cadenas cortas de ADN de simple cadena coincide con el tamaño de los fragmentos de Okasaki. De acuerdo a este modelo, la replicación continúa hasta terminar en el polo opuesto al origen de replicación. Es muy probable que después de este ciclo replicativo, las dos nuevas cadenas circulares que forman dos cromosomas del fago se presenten en forma concatenada. La separación de estas no sería posible sin la intervención de una ADN-topoisomerasa.

La replicación temprana procede en forma exponencial, y el número de moléculas se duplica cada 2 - 3 min. Sin embargo, no todas las moléculas están en estado replicativo en cualquier momento, sólo ~20% de las moléculas se replican. Adicionalmente, puede observarse que alrededor de 50 moléculas por célula están en forma monomérica helicoidal antes de que transcurran los primeros 15 min de la infección.

Replicación tardía

Durante el crecimiento lítico a 37°C en medio rico, la replicación temprana cesa ~15 min de la infección, y da lugar a la síntesis de concatémeros (cromosomas lineales de ADN de λ ligados covalentemente de la cápside y la tallo). Estos pueden ser empaquetados inmediatamente.

La primera evidencia de la síntesis del ADN concatemérico viene de las observaciones por la sedimentación del ADN radioquimicamente marcado. Moléculas de dos y hasta ocho veces la longitud del ADN monomérico de λ han sido claramente observada después de los 15 minutos en fagos mutantes deficientes en el ensamblaje de la cápside. La posibilidad de que estos concatémeros pudieran venir del producto de la recombinación, fue eliminada haciendo los experimentos en ausencia de los sistemas de recombinación, es decir en cepas bacterianas recA^--, así como de los fagos red^-- e int^--. El modelo del círculo rodante provee un posible mecanismo para la síntesis de ADN concatemérico. Una de las cadenas del ADN parental sirve como templado, mientras que la complementaria tiene un corte. La síntesis se inicia en el extremo 3´-hidroxilo terminal y continuando a través del círculo varias veces, produciendo ADN de cadena sencilla. Esta cadena lineal es utilizada como templado para la síntesis de su cadena complementaria. A tiempos tardíos en la infección, la mayoría de los cromosomas del fago está en la forma σ. La replicación al igual que en la forma Θ, puede llevarse a cabo en forma bidireccional, o sea, puede replicarse tomando una u otra de las cadenas parentales como templado. Se ha observado que ~40% de la forma replicativa σ tiene un mismo origen, y coincide con el origen de replicación de Θ. Algunas de las formas replicativas σ pueden derivar en forma directa por la inactivación de alguna de las asas replicativas de Θ.

Control de la Replicación tardía

Al parecer, no existe un mecanismo de transición entre las fases temprana y la tardía en la replicación de λ. Las investigaciones sobre un hipotético gen esencial que media el cambio entre la forma Θ y la forma σ han sido del todo infructuosas. Así, la idea de un cambio puede ser errónea. Un punto de vista alterno, es que tanto la forma Θ como σ se inicien temprano en la infección, pero la replicación de Θ se pare tempranamente, mientras que la de σ persista hasta tiempos tardíos. Se ha observado que una tercera parte de las moléculas en los primeros ciclos de replicación son de la forma σ. Un importante factor que podría regular la transición de la fase temprana a la tardía, es la disponibilidad de las proteínas O y P. La expresión de O y P es limitada a tiempos tardíos por la presencia de la proteína Cro, ya que evita la transcripción a partir del promotor pR. Se ha observado que cuando la síntesis del ADN es retardada por la limitación de la cantidad de las proteínas O y P activas después de la infección, las primeras formas replicativas observadas son generalmente de la forma σ.

El producto del gen gam de λ , claramente juega un papel importante en la síntesis de concatémeros de ADN, y el producto del gen red pudiera también ser de importancia. La doble mutante gam^--red^-- de λ, es incapaz de formar placas en un tapiz bacteriano recA^-- (deficiente en recombinación). Bajo estas condiciones, la síntesis de ADN ocurre, pero se acumulan muy pocos concatémeros de ADN. Algunas formas del tipo σ pueden ser detectadas, pero sus cadenas laterales son muy cortas. Sin embargo, el defecto de la replicación del circulo rodante de la mutante gam^--red^-- de λ puede ser restituida por la doble mutante del huésped recA^-- y redB^-- o redC^-- o recD^--, sintetizando concatémeros eficientemente. Así, la función crítica de la proteína Gam es la de inhibir la actividad de la exonucleasa V codificada por los genes recB, recC y recD que destruye los concatémeros.

La función de Red y las funciones de recombinación del huésped son menos claras, posiblemente generan recombinantes entre monómeros circulares. Los multímeros resultantes llevarían al menos dos sitios cos, sustratos para una eficiente encapsidación. En efecto, si la replicación normal es bloqueada, la recombinación llega a ser necesaria para la maduración de los cromosomas de λ.

Iniciación de la Replicación de λ

Resulta claro que tanto para la forma Θ, así como para el 40% de la forma σ, la replicación, se inicia en un origen único ori. El origen de replicación en sus inicios fue determinado por mapeo con las microfotografias electrónicas, tomando desde el origen de las asas replicativas y extrapolando a la región cero de replicación. Esto ubicó al ori entre 81.7 ± 2.9% en relación al extremo izquierdo del genoma de λ, y muy cerca de los genes O y P. Posteriormente, estudios genéticos determinaron con más precisión el sitio de control para la iniciación de la replicación. Este sitio estuvo localizado dentro del gen O, aproximadamente a 80.5 - 80.6% del extremo izquierdo del genoma λ. El origen de replicación fue determinado probando diferentes mutantes con deleciones cercanas a y dentro del gen O, observándose si la replicación se llevaba a cabo o no en profagos. Una vez delimitada esta región, se clonó en regiones no esenciales de fagos o en plásmidos, y por complementación de O y P, se observaron si eran capaces de replicar o no. Una región entre el promotor pR y un sitio EcoRI dentro del gen O permite que se replique eficientemente tanto en el sistema de profagos y de plásmidos. Sin embargo, una región de 34 pb a la derecha del sitio EcoRI incrementó la replicación de 20 a 30 veces en el sistema plasmídico. Así, pruebas con deleciones indicaron que los límites de ori están comprendidos a no mas de 200 pb del sitio EcoRI. Se han propuestos otros sitios mas distantes como el sitio ice (inceptor sequence) dentro del gen cII y localizado a 600 pb a la izquierda de ori que facilitan la replicación. Sin embargo, deleciones en este sitio han permitido una buena replicación, por lo que a ori se le considera el único sitio indispensable para que se lleve a cabo una replicación normal. Debido a la capacidad de suplir la actividad de O por complementación, se pudieron hacer ensayos más finos mutando el origen de replicación (dentro del gen O) y se definió un segmento mínimo de 63 pb como el origen de la replicación. Sorprendentemente, esta región presenta cuatro cajas muy parecidas de 19 pb conteniendo repetidos invertidos y separados unos de otro por pocas bases. El ADN de esta región puede modelarse como una estructura de un trébol complejo, sugiriendo que pudiese ser el estado activo del ADN para el inicio de la replicación. El origen ori tiene otra estructura no usual a la derecha de los repetidos, la cual es rica en pares de A·T y exponiendo una distribución asimétrica de purinas y pirimidinas. Estas propiedades deben facilitar la desnaturalización local de la doble hélice.

La interacción específica entre la proteína O y el segmento ori ha sido identificado por análisis genéticos y bioquímicos. La proteína O, de 34,000 daltones, actúa en forma dimérica. La región amino terminal de O es esencial para el reconocimiento del ADN y se une a una región de 95 pb en la cual están contenidas las cuatro cajas.

La proteína P es una proteína de 26,000 daltones que de acuerdo a las evidencias genéticas sugieren que también puede interactuar con la proteína O. Mutaciones del tipo temperatura sensible pueden ser suprimidas por mutaciones que mapean en P. La proteína híbrida O que contiene la parte amino terminal de λ y la parte carboxilo terminal O de Φ80, funciona eficientemente para la replicación con la proteína P del fago Φ80 pero no con la proteína P de λ, indicando que la interacción a P es con la parte carboxilo terminal de O. La proteína P interactúa con diferentes proteínas del huésped, entre estas la mejor caracterizada es con la helicasa del huésped DnaB. La asociación con la proteína DnaB y su modificación en su actividad podrían permitir que DnaB entre al complejo replicativo del ADN de λ.

Para que se inicie la replicación se requiere de la salida de P del complejo de iniciación, para ésto DnaJ/DnaK se asocian a P dejando libre a DnaB. El producto de los genes grpD y grpE están involucrados también en la salida y regeneración de P. Además de las proteínas replicativas y al sitio ori, la iniciación de la replicación requiere una activación transcripcional de la síntesis de un ARN cercano al origen de la replicación. En una lisógena para λ cuando se coinfecta con el mismo fago y un fago auxiliar heteroinmune que provee las proteínas O y P de λ, el genoma reprimido de lambda no es capaz de replicarse indicando la necesidad de la activación transcripcional.

Existen algunos antibióticos como la rifampicina que inhiben la replicación. Su acción es indirecta, ya que al inhibir la transcripción de pR, evita la activación transcripcional para la replicación. Similarmente, existen otros antibióticos que inhiben indirectamente la replicación como son el Ac. Nalidíxico y la Coumermicina, inhibidores de la ADN-girasa. Esto sugiere que el sustrato para la iniciación de la replicación debe ser un sistema de ADN superenrollado. El mecanismo propiamente de la replicación como el reconocimiento para su iniciación, el complejo ARN polimerasa para la elongación y para la terminación es muy similar a la que ocurre con su huésped E. coli y se recomienda ver el capítulo de la Replicación en E. coli.

Ensamblaje de las partículas virales de lambda

λ presenta la cápside en forma de icosaedro, que contiene el ADN de doble cadena. Estas son partículas víricas pequeñas de 55 nm de diámetro que guardan en su interior al genoma completo de λ de 16,500 nm de largo. La construcción de la cápside y el posterior empaquetamiento del ADN comprende la participación de proteínas del fago y de la bacteria.

El ADN concatemérico, producto de la replicación de la forma σ, y los precursores de las cápsides interactúan mediante el reconocimiento de las regiones cos por parte de la enzima terminasa que se encarga del empaquetamiento y corte posterior en la región cos. La entrada de solamente una unidad cromosomal por cápside es controlada por el reconocimiento del sitio cos terminal por la terminasa. Sin embargo, es posible introducir ADN heterólogo con gran eficiencia en vectores que cuenten con las regiones cos al ser empaquetados en reacciones in vitro.

La cápside del virión se forma independientemente del ensamble del tallo, y al unirse ambos conforman la partícula viral madura. Se requiere de la participación de cuatro proteínas del fago y por lo menos de dos proteínas de la bacteria para formar la cápside. La proteína E forma la estructura del poliedro principal y la proteína D se encuentra en la superficie formando un arreglo eicosaédrico en la cápside madura.

Las proteínas B, C y Nu3 del fago junto con las proteínas GroEL y GroES del huésped interactúan para formar la cápside primitiva. Las proteínas del huésped son necesarias para evitar malformaciones de la cápside al ensamblarse las proteínas E y Nu3. La proteína Nu3 facilita el ensamble de las proteínas E, B y C en la estructura del precursor. La proteína B forma el conector entre la cápside y el tallo del virión, el cual está dispuesto en forma de un anillo con un orificio central. Este será el orificio de la entrada del ADN. Durante la maduración de la cápside, la proteína B es escindida para formar la proteína B* en tanto que la proteína Nu3 es degradada y removida de la estructura. Las proteínas C y E participan en una fusión para formar proteínas híbridas X1 y X2 (Fig. 11).

Como se mencionó antes, en la etapa final de maduración requiere del empaquetamiento del ADN dentro de la cápside. El ADN concatemérico del fago es reconocido en el sitio cos por la terminasa (complejo I), también se necesita la participación de dos proteínas del hospedero, las proteínas IHF y THF, para que se realice el corte en el sitio cos. La terminasa de λ consiste de dos subunidades (Nu1 y A) que reconoce secuencias especificas en la región cos. Solo se sintetizan de 100 a 200 moléculas de terminasa en el curso de una infección. El reconocimiento es llevado a cabo gracias al motivo α hélice -vuelta- α hélice de la subunidad pequeña de la enzima Nu1. Esta subunidad se une a 3 o a 4 secuencias repetidas en la región cos. La subunidad mayor tiene actividad de endonucleasa que rompe el enlace fosfodiester en una de las cadenas (nick). En el sitio cos se localizan dos de estos sitios en cadenas opuestas y a una distancia de 12 nucleótidos. La afinidad de la terminasa en la región de cos es estimulada por la unión y doblamiento del ADN, efectuado por el factor IHF del huésped.

La unión del complejo I al precursor de la cápside genera el complejo II, cuya reacción es potenciada por la proteína FI del fago (Fig. 11). La entrada del genoma de λ a la cápside se realiza en forma polar, es decir, la dirección de empaquetamiento del ADN es del gen Nu1 a R. La terminasa no solo se encarga del reconocimiento de los sitios cos, sino también de la unión de este con el precursor de la cápside, y establece el origen y dirección de empaquetamiento. El empaquetamiento requiere de la hidrólisis de ATP para la condensación del ADN de 30 a 200 veces dentro de la cápside. Durante el empaquetamiento del ADN, la cápside sufre una expansión del 75% en su tamaño, dejando espacios en la estructura de la red conformada por la proteína E. Estos nuevos espacios son ocupados por la proteína D en un número equivalente al de la proteína E, brindándole estabilidad a la cápside madura. El corte del ADN en su región cos termina con el empaquetamiento, la terminasa se disocia de la cápside madura pero continua unida al ADN concatemérico para formar un nuevo complejo II con otro precursor de la cápside. En tanto que las proteínas W y FII se unen al conector del tallo para evitar la salida del ADN y formar el sitio de unión del tallo con la cápside madura.

En tanto, el ensamblaje del tallo se lleva a cabo en forma independiente de la cápside. El tallo del fago λ consiste de un tubo flexible (no contráctil como en el caso de T4) de 135 nm con un extremo cónico de 15 nm, una fibra terminal de 23 nm. Se compone principalmente de 32 anillos apilados compuesto cada uno de 6 subunidades de la proteína V. El producto del gen J compone la fibra terminal que interacciona directamente con el receptor LamB de la superficie de la bacteria.

El ensamblaje de la partícula viral se debe principalmente a un fino equilibrio de las diferentes proteínas de la cápside y tallo. Los genes estructurales no se encuentran dispuesto al azar en el genoma de λ sino que los genes de la cápside y del tallo se hallan agrupados en dos regiones que no se solapan. Es interesante notar que los productos de genes que interactúan durante el ensamblaje se encuentran codificados en genes adyacentes. Los polipéptidos precursores son sintetizados secuencialmente en las cantidades apropiadas durante el ensamblaje, a pesar de ser transcriptos a partir de un solo promotor (pR').

Esto se explica por la expresión diferencial de las proteínas, producto de la traducción diferencial de los cistrones. Pero si se altera la producción de algunas proteínas, se produce un ensamblaje inadecuado que deriva en la formación de cápsides defectuosas.

Lisis Celular

Una vez formadas las partículas virales, éstas deberán salir y dispersarse para encontrar nuevas bacterias y poder multiplicarse. Una de las principales barreras para la salida de las partículas es la malla continua de peptidoglicanos de la pared celular. Esta estructura es estable y resistente y permite mantener la presión osmótica interna de la célula.

La estrategia que sigue el bacteriófago para sortear esta barrera es producir una endolisina para degradar los componentes de la pared celular. La endolisina es una transglicosilasa que por si sola no es capaz de llegar a su sustrato porque la pared celular se encuentra separado del citosol por la membrana celular, y para llegar a éste requiere de un segundo factor lítico, la holina. Esta es una proteína de membrana que daña a la membrana interna y da libre acceso de la endolisina a la pared celular (Fig.12).

Los genes de la holina y endolisina, S y R respectivamente del genoma del fago λ, están localizados en el inicio de la unidad transcripcional tardía, bajo el control del promotor pR´. Este se "prende" aproximadamente a los 8 min del ciclo vegetativo y se expresa en forma constitutiva. La endolisina activa se acumula en el citosol, no teniendo acceso inmediato a su sustrato. La holina forma lesiones en la membrana que terminan con la respiración y permiten que la endolisina ataque a la mureína. La más simple explicación, es que la holina forme poros, y permita que la endolisina cruce la membrana celular. Deleciones en los genes de los holina permite que la respiración continúe, así como la síntesis macromolecular, observándose un incremento de la masa celular, con una acumulación de viriones en el citosol. Una característica común del sistema basado en la holina es su dependencia con la membrana energizada, ya que la adición de venenos contra su sistema energético, instantáneamente disparan la acción de la holina. Este fenómeno de la lisis prematura sugiere que el mecanismo de cronometraje de la lisis depende de la membrana energizada.

Propiedades de la holina

El gen S de la holina codifica para dos péptidos: uno de 105 aminoácidos y otro similar, pero con 2 aminoácidos adicionales, o sea de 107 aminoácidos, presenta 3 regiones transmembranales con la topología amino terminal siempre hacia fuera y el carboxilo terminal hacia el citosol. La holina puede unirse al menos en multímeros de seis para formar el poro. La parte citoplasmática del carboxilo terminal es necesaria para la formación del poro y tiene un papel regulatorio, dependiendo de sus residuos cargados positivamente. Se ha observado que una misma mutación en la región transmembranal 2 (TM2) que cambia la alanina por valina (A52V), le confiere un defecto total en la lisis, acumulándose los viriones mas de la cuenta. Mientras que la mutación alanina por glicina (A52G) causa una catastrófica lisis temprana, ~20 min, antes de que el primer virion sea ensamblado. Si no se tiene algo adicional, esta es una prueba de que la holina tiene dos funciones esenciales: causar la lisis permeabilizando la membrana y retardar la lisis hasta que el programa del ensamblaje del virión haya generado un número suficiente de viriones.

Regulación de la función de la holina

¿Qué es lo que hace que la holina dispare la formación del poro en el minuto 50 sin hacerlo antes o después?, y sabiendo que ciertos venenos que interfieren con el proceso energético disparan prematuramente la lisis. ¿Cuál es el papel de las membranas energizadas?. Parte de la respuesta está en la proteína de 107 residuos. Tanto la holina activa de 105 aminoácidos, así como la inhibitoria de 107 aminoácidos, son traducidas de diferentes Shine Dalgarno. El cronometraje de la lisis depende de la proporción de las dos proteínas, la cual es 2:1 a favor de la de 105 aminoácidos, bajo condiciones estándares de cultivo. La función inhibitoria de la proteína de 107 es su carga positiva de la posición 2 (lisina). Graschopf y Bläsi fusionando una secuencia señal en la parte amino terminal de 107, eliminan su capacidad inhibitoria y la convierte en una holina activa. Estas consideraciones han permitido proponer un modelo para el evento del disparo de la holina, su dependencia energética, y su mecanismo inhibitorio.

La holina S es insertada en la membrana formando una estructura de horquilla con las regiones TM2 y TM3. La formación del poro deberá requerir que la estructura final tenga 3 regiones TM, por la penetración amino terminal a través de la capa bilipídica. Así, el inhibidor 107 es defectuosa en llevar a cabo este reacomodo ya que presenta una carga positiva extra en la porción amino terminal.

Alterando artificialmente la proporción del inhibidor o de la holina, se puede retardar o acelerar la lisis, respectivamente, sugiriendo que la habilidad para retardar la lisis del inhibidor 107 es un evento poblacional.

Debería parecer que la relación holina - inhibidor estuviera activamente regulado bajo condiciones fisiológicas, donde un ciclo vegetativo más extendido pudiera ser favorecido, pero aún no se tienen evidencias que tal regulación haya sido reportado.