El género Actinomadura como una fuente de principios biodinámicos de interés medicinal y agroquímico

María Teresa Gutiérrez-Lugo y Rachel Mata Essayag


Introducción

A raíz del descubrimiento de la penicilina y otros antibióticos se inició una nueva era en las investigaciones de diversos microorganismos como fuentes valiosas de principios biodinámicos de interés terapéutico y agroquímico. (7, 9, 78, 79, 109, 118). De importancia terapéutica se han descubierto, además de una gran variedad de antibióticos, compuestos útiles para el tratamiento de padecimientos cardiovasculares, cáncer, trastornos de tipo inmunológico y antihelmínticos (4, 78, 79, 102, 118). Por otro lado, en lo que se refiere a los A productos de interés agroquímico se han identificado un gran número de insecticidas, herbicidas y fungicidas (24, 29, 40, 42, 46, 57, 109).

Muchos de los productos naturales microbianos de importancia económica se obtienen a partir de actinomicetos, estimándose que aproximadamente el 68 % de estos productos son biosintetizados por actinomicetos del género Streptomyces (5, 15, 41, 43, 56, 72, 78, 79). Sin embargo, otros géneros entre los que destacan Micromonospora, Nocardia, Actinoplanes, Streptoverticillium y Actinomadura son fuentes valiosas de metabolitos bioactivos de aplicación terapéutica y agroquímica (41, 43, 120).

En este capítulo se describen los aspectos más relevantes del género Actinomadura como una fuente potencial de principios biodinámicos. Así mismo se describirá el aislamiento, caracterización y propiedades fitotóxicas del antibiótico maduramicina obtenido a partir de un aislamiento de Actinomadura proveniente de una muestra de suelo volcánica recolectada en el Municipio de Santa Rosalía, Baja California Sur, México.

Generalidades de los actinomicetos

Los actinomicetos y microorganismos relacionados probablemente representan el grupo de bacterias más grande y diverso. Este grupo esta conformado por microorganismos gram positivos, unicelulares, en forma de bacilos y microorganismos filamentosos. Los actinomicetos comprenden al grupo Corineforme y al orden de los Actinomicetales (6).

Las bacterias Corineformes son bacilos gram positivos que se agrupan en palisadas también denominadas "letras chinas". Uno de los géneros principales es Corynebacterium cuyas especies son patógenas de humanos, animales y plantas. El grupo Corineforme rara vez produce un crecimiento filamentoso, pero posee componentes en su pared celular similares a los de los Actinomicetales (6).

El orden de los Actinomicetales comprende 63 géneros y casi todos sus miembros desarrollan un micelio filamentoso. Esta última estructura puede permanecer unida a la superficie del sustrato, al cual se le denomina micelio sustrato o bien desarrollarse hacia la parte externa en cuyo caso se denomina micelio aéreo. Los filamentos individuales o hifas del micelio se subdividen en unidades producto de un crecimiento de la pared celular hacia el interior de la hifa en intervalos regulares a lo largo de esta estructura. A este proceso se le denomina septación y cada una de las septas resultantes contienen una molécula de DNA (6).

Una característica particular de los actinomicetales es que la reproducción lleva a la formación de esporas que son producidas en hifas especializadas, muchas de las cuales se desarrollan sobre el filamento aéreo. De manera general, estas estructuras carecen de movilidad aunque algunos géneros producen esporas flageladas. Las esporas producidas por la mayoría de las especies no son resistentes al calor. Sólo la familia Thermoactinomicetaceae produce esporas de este tipo que son similares en composición química a las endosporas de Bacillus y Clostridium. La forma, número y disposición de las esporas es una característica particular de cada género (6).

La mayoría de los actinomicetales son aerobios (actinomicetos oxidativos), aunque algunos de ellos son anaerobios facultativos u obligados (actinomicetos fermentativos) (6).

Los actinomicetales se encuentran distribuidos en diferentes hábitats, sin embargo su reservorio natural es el suelo en donde su función ecológica principal es la descomposición de la materia orgánica. Los actinomicetales comprenden aproximadamente el 20-60 % de la población microbiana del suelo. El olor característico a tierra húmeda se debe a su actividad metabólica y a la producción de pigmentos, terpenoides (geosminas) y enzimas extracelulares que son capaces de degradar materia orgánica de origen vegetal y animal. Algunas otras especies son patógenos de humanos, animales o plantas o son fijadores de nitrógeno (6).

Además de la función ecológica de los actinomicetos, estos microorganismos son de suma importancia debido a que han demostrado ser la fuente más importante de metabolitos secundarios bioactivos de valor industrial y comercial (5, 15, 41, 43, 56, 72, 78, 79).

Antecedentes del género Actinomadura

El término Actinomadura proviene del vocablo griego actinos que significa rayo de luz y de Madura; nombre de una provincia de la India.

El género Actinomadura fue propuesto por Lechevalier y Lechevalier en 1970 para agrupar a una serie de actinomicetos aerobios que desarrollan micelios substrato y aéreo, producen esporas (artrosporas) en cadenas y cuyos hidrolizados celulares contienen meso-DAP (ácido 2,6-diaminopimelico) y madurosa (3-O-metil-D-galactosa). Estos mismos autores designaron como especie tipo a la Actinomadura madurae, uno de los agentes causales de un tipo de micetoma denominado "pie de Madura". Este padecimiento se caracteriza por ocasionar tumefacciones supurantes en la piel y tejidos subcutáneos y se generan cuando un suelo contaminado con esta especie penetra en las heridas. Estas infecciones cutáneas se presentan con mayor frecuencia en las extremidades inferiores. Inicialmente A. madurae, descubierta por Vincent en 1894 fue clasificada como Streptothrix madurae. Posteriormente, en 1896 Blanchard la reclasificó como Nocardia madurae (Vincent) Blanchard (66).

En 1906, Laveran describió otro microorganismo causante de la enfermedad de pie de Madura y lo clasificó en primera instancia como Micrococcus pelletieri y posteriormente como Nocardia pellieteri. Tanto la N. madurae de Blanchard como la N. pellieteri de Laveran carecían del micelio fragmentado típico del género Nocardia, considerándose entonces como especies atípicas. Más tarde Waksman y Henrici transfirieron a N. pellieteri y a N. madurae al género Streptomyces. Sin embargo, esta reclasificación también fue controversial y no fue sino hasta 1965 cuando Becker y colaboradores demostraron que los hidrolizados celulares de estos microorganismos contenían meso-DAP (ácido meso-diamino pimélico) y un azúcar desconocido, la madurosa, posteriormente identificada por Lechevalier y Gerber (1970) como la 3-O-metil-D-galactosa. Este descubrimiento conllevó a Lechevalier y Lechevalier a proponer el género Actinomadura para incluir a estas dos especies. Es importante indicar que los hidrolizados celulares de los microorganismos típicos del género Nocardia contienen meso-DAP, galactosa y arabinosa y los del género Streptomyces contienen L-DAP y no contienen madurosa (66).

El género Actinomadura pertenece al orden de los Actinomicetales y su inclusión en una familia todavía no esta definida. Inicialmente, Lechevalier y Lechevalier colocaron al género dentro de la familia Thermoactinomycetaceae, cuyos miembros se caracterizan por formar endosporas, rasgo ausente el las especies de Actinomadura. En consecuencia se propuso una nueva familia, Thermomonosporaceae, para incluir a Actinomadura junto con Microbispora, Microtetraspora y otros géneros relacionados. Esta colocación fue de nueva cuenta cuestionada. De tal forma que Godfellow y Cross propusieron la creación de nueve "grupos agregados" con base en los criterios quimiotaxonómicos y de taxonomía numérica. Uno de los "grupos agregados" es el de los "Maduromicetos" el cual comprende a los géneros Actinomadura, Microbispora, Microtetraspora, Planomonospora, Planobispora, Spirillospora y Streptosporangium (66).

Los microorganismos del género Actinomadura son bacterias gram positivas, no alcohol resistente, aerobias, quimiorganotrópicas y crecen en un intervalo de temperatura de 10-60° C. Desde el punto de vista morfológico las especies de este género se caracterizan por presentar una gran cantidad de hifas vegetativas ramificadas y un denso micelio substrato no fragmentado. Prácticamente todas las especies desarrollan un micelio aéreo, el cual puede presentar una coloración azul, café, crema, gris, verde, rosa, roja, blanca o amarilla. En la madurez el micelio aéreo forma cadenas de artrosporas cortas y ocasionalmente largas. Las cadenas de esporas pueden ser rectas, curvas o espirales irregulares. La superficie de las esporas puede tener una apariencia rugosa, irregular o suave (6, 66).

En algunos casos las características microscópicas de los microorganismos del género Actinomadura se confunde con las del género Streptomyces. La principal diferencia radica en la magnitud del diámetro de las esporas. El diámetro de las esporas de las cepas de Actinomadura notablemente excede el diámetro de la hifa, mientras que el diámetro de las esporas de los microorganismos del género Streptomyces es similar al de la hifa (Fig. 1). Las cepas de fuentes clínicas carecen de micelio aéreo y las colonias presentan una apariencia cartilaginosa.

La composición de los hidrolizados celulares de los microorganismos del género Actinomadura contienen ácido meso 2,6-diaminopimélico, ácido N-acetilmurámico, galactosa, glucosa, manosa, ribosa y madurosa, esta última en ocasiones se encuentra en pequeña cantidad. De manera adicional, los hidrolizados presentan una mezcla compleja de ácidos grasos siendo los más abundantes el hexadecanioco, el 14-metilpentadecanoico y el 10-metiloctadecanoico. Estos organismos no producen ácido micólico y sus fosfolípidos mayoritarios son el difosfatidilglicerol y el fosfatidilinositol. Contienen también las menaquinonas MK-9 (H4, H6, y H8) (6).

Los miembros del género Actinomadura se encuentran ampliamente distribuidos en el suelo y de acuerdo a la información más reciente publicada en la literatura científica, este género comprende aproximadamente 27 especies: A. atramentaria, A. aurantica, A. citrea, A. coerulea, A. cremea, A. echinospora, A. fibrosa, A. formosensis, A. fulvescens, A. hibisca, A. kijaniata, A. latina, A libanotica, A. livida, A. luteofluorescens, A. macra, A. madurae, A. oligospora, A. pelletieri, A. rubrobrunea, A. rugatobispora, A. spadix, A. umbrina, A. verrucosospora, A. vinacee, A. viridis, A. yumaensis (6, 54, 115, 126). Cabe destacar que la especie Actinomadura formosensis fue recientemente reclasificada del género Thermomonospora al género Actinomadura con base en el análisis de la secuencia del gen del RNA ribosomal 16 S y sus características quimiotaxonómicas. En particular considerando la presencia de madurosa en los hidrolizados celulares del microorganismo (126).

La mayoría de las especies de Actinomadura son inocuas para animales y el hombre, sin embargo las especies A. madurae y A. pelletieri son los agentes causales de actinomicetomas. La mayoría de los reportes de infecciones por estas especies son de áreas tropicales y subtropicales particularmente de Africa, México y la India (1, 3, 11, 16, 48, 60, 65, 85, 119, 123).

Metabolitos secundarios del género Actinomadura

El género Actinomadura es una fuente importante de compuestos biodinámicos. Los metabolitos activos derivados de este género presentan una gran diversidad estructural y un amplio rango de actividades biológicas. Los productos más importantes aislados a la fecha a partir de los medios de cultivo de las distintas especies estudiadas incluyen 5,6-dihidrobenzo[a]naftacenoquinonas, benzoantraquinonas, nucleosidos, antraciclinas, ansamicinas, macrolactamas, macrólidos, aminoglocosidos, glucopéptidos, tetraciclinas y antibióticos de tipo polieter. En los Cuadros 1a, 1b, 1c, 1d, 1e, 1f, 1g , 1h, 1i, 1j, 1k, 1l, 1m, 2a, 2b, 2c y 2d se presentan ejemplos representativos de los metabolitos bioactivos aislados de especies del género Actinomadura.

Además de los productos antes mencionados también se han aislado antibióticos de tipo peptidico y nucleótido de estructura desconocida. Estos antibióticos se clasifican en cromopeptidos, oligopeptidos y oligonucleotidos y han demostrado propiedades antitumorales y antibacterianas (33, 49, 50, 117).

Los metabolitos microbianos derivados del género Actinomadura que han recibido una mayor atención son los compuestos de tipo 5,6-dihidrobenzo[a]naftacenoquinona y los antibióticos polieter.

Las 5,6-dihidrobenzo[a]naftacenoquinonas poseen propiedades antifúngicas de amplio espectro e incluyen dos grupos de compuestos denominados con los nombres triviales de pradimicinas y benanomicinas (Cuadros 1a, 1b, 1c, 1d, 1e, 1f, 1g , 1h, 1i, 1j, 1k, 1l, 1m, 2a, 2b, 2c y 2d). En general estas quinonas se encuentran bajo la forma de glicósidos y contienen un aminoácido unido al carbono 15 del núcleo base. Los compuestos descritos a la fecha se diferencian entre sí por la naturaleza del aminoácido (D-alanina, glicina o serina) en C-15 y de la porción sacarida unida en C-5, generalmente un disacarido, con excepción de los compuestos 2, 11, 14, 21 y 22 que contiene una sola unidad sacárida.

En las pradimicinas y benanomicinas 1-9, 12-14, 20 y 22 el azúcar unido a la porción aglicona es un aminoazucar, en tanto que la segunda unidad sacárida puede ser xilosa, glucosa o 3-sulfoglucosa. En algunas benanomicinas (compuestos 19, 21, 23 y 24 el grupo amino de la primera unidad se encuentra substituido por un grupo hidroxilo (Cuadros 1a, 1b, 1c, 1d, 1e, 1f, 1g , 1h, 1i, 1j, 1k, 1l, 1m, 2a, 2b, 2c y 2d).

El grupo de las pradimicinas esta constituido aproximadamente por 18 compuestos (Cuadros 1a, 1b, 1c, 1d, 1e, 1f, 1g , 1h, 1i, 1j, 1k, 1l, 1m, 2a, 2b, 2c y 2d), de los cuales siete son naturales (productos 1-7), cuatro son producidas por cepas mutantes de especies del género Actinomadura (estructuras 15-18) y las restantes se han obtenido a través de biosíntesis dirigida (productos 8-14) (76, 77, 91-93, 112, 116). Las pradimicinas M ( 15), N ( 16), O ( 17) y P ( 18) derivadas de cepas mutantes de A. hibisca P157-2 carecen del grupo disacarido y de la actividad antifúngica (96). Por otro lado, las pradimicinas derivadas de procesos de biosíntesis dirigida son análogos de las pradimicinas o de las benanomicinas naturales que poseen en su estructura el aminoácido serina en lugar del aminoácido alanina. Así, la pradimicina FL ( 12) análogo de la pradimicina L ( 6), demostró una actividad antifungica mayor a la del correspondiente producto natural (93).

Una de las pradimicinas que ha recibido mayor atención es la pradimicina BMS-181184 ( 10), un análogo de la pradimicina A ( 1) soluble en agua. Este compuesto fue producido exitosamente por fermentación de Actinomadura sp. en presencia de D-serina y D-cicloserina, ambos inhibidores de la enzima alanina racemasa. Actualmente este producto se encuentra en la fase de investigación clínica I para el tratamiento parenteral de infecciones. Se ha postulado que la actividad fungicida de las pradimicinas se debe a la unión de estos productos a la porción sacarida de la manoproteína de la superficie celular fúngica provocando alteraciones en las concentraciones intracelulares de potasio y en consecuencia severas alteraciones morfológicas (102).

Kakinuma y colaboradores (47) propusieron una ruta biosintética para las 5,6-dihidrobenzo[a]naftacenoquinona mediante el empleo de capas mutantes de A. verrucosospora subs. neohibisca E-40 (productor de pradimicina) y Actinomadura sp. AB1236 (productor de benanomicina). La ruta biosintética consiste de siete pasos y se resume en la Fig. 2.

Recientemente, se reportó la identificación y clonación del gen de la enzima policetido sintetasa esencial para la biosíntesis de la pradimicina A de A. verrucosospora. El análisis de la secuencia de un fragmento de 3.5 Kb (Sal I-Sph I) del gen demostró que las subunidades de la cetosintetasa tiene una gran similitud (59-89%) con las cetosintetasas involucradas en la biosíntesis de los antibióticos de tipo anguciclico (15).

Los antibióticos de tipo polieter son metabolitos de naturaleza policetido que poseen propiedades ionóforas. Desde el punto de vista biosíntetico los antibióticos de tipo polieter se generan por la ruta acetato malonato a través de la condensación de unidades acetato, malonato, propionato y butirato. Estos antibióticos contienen en la molécula de tres a seis anillos de naturaleza tetrahidrofurano y tetrahidropirano. Más de la mitad de los antibióticos polieter conocidos presentan de una a cuatro funciones de éter cíclico formando sistemas mono y diespirocetal (58, 87).

En general, los antibióticos de tipo polieter contienen un grupo carboxilo en un extremo de la molécula y una función hidroxilo en el otro. De manera adicional, todos poseen en su estructura varios grupos metilo y funciones de tipo cetal y hemicetal. Estos antibióticos se presentan en la naturaleza como ácidos libres o formando sales con cationes metálicos de los grupos I (Li +, Na +, K +,) y II (Ca++, Ba++) (110).

Los antibióticos de tipo polieter se dividen en cinco grupos estructurales (grupos I-V) de acuerdo a sus características espectroscópicas (RMN 13C) (98). En los cuadros 3a y 3b se resumen las características espectroscópicas de cada uno de los cinco grupos estructurales de los antibióticos de tipo polieter. Estos antibióticos se clasifican también en monovalentes y divalentes de acuerdo a la naturaleza de los cationes que complejan (124).

La importancia de los antibióticos de tipo polieter radica en su aplicación en la medicina veterinaria como agentes anticoccidia y promotores de crecimiento de aves (80, 89). Los antibióticos de tipo polieter empleados para este fin en Estados Unidos de Norteamérica son la monesina, la lasalocida, la narasina, la salinomicina y la maduramicina (Cuadro 4). Otros se utilizan como herramienta bioquímica para el estudio del transporte de cationes y para la construcción de electrodos selectivos (107).

Los microorganismos productores de antibióticos de tipo polieter pertenencen a los géneros Streptomyces, Streptoverticillium, Actinomadura y Dactylosporangium. Es interesante indicar que aproximadamente la mitad de los antibióticos de tipo polieter conocidos son producidos por diferentes cepas de las especies S. hygroscopicus y S. albus (86). Sin embargo, el género Actinomadura biosintetiza un grupo importante de antibióticos de tipo polieter de interés comercial.

Como puede observarse en los cuadros 2a, 2b, 2c, 2d, la mayoría de los antibióticos de tipo polieter producidos por las especies del género Actinomadura pertenecen al grupo III en la clasificación propuesta por Seto y Otake (98). Este grupo se caracteriza por presentar en su estructura un sistema espirocetal, carbonos de tipo hemicetal y diversos grupos metoxilo. Algunos de ellos son monoglicósidos como en el caso de los antibióticos CP 47, 433 ( 75), CP-47.434 ( 76), la maduramicina ( 80), la 27-metoxiseptamicina ( 82) y CP-84, 657 (85) o diglicósidos como los productos UK-58, 852 (83) y CP-82, 996 (84) cuadros 2a, 2b , 2c, 2d,).

Dos productos interesantes desde el punto de vista estructural son los antibióticos CP-54, 883 ( 81) y SF2487 ( 86) (cuadros 2a, 2b, 2c, 2d,). El producto 81 contiene en su estructura un anillo arómatico substituído con átomos de cloro. Por otro lado, el antibiótico 86 posee la particularidad de presentar una unidad de ácido aciltetronico.

Los antibióticos de tipo poliéter de mayor interés comercial son la maduramicina y la semduramcina. La primera fue descubierta y caracterizada de manera independiente por dos laboratorios farmacéuticos: Hoffmann-La Roche y American Cyanamid. Hoffmann-La Roche lo designó como antibiótico X-14868 A (59, 60), mientras que American Cyanamid acuño el nombre genérico de maduramicina (55). El microorganismo productor del antibiótico es A. yumaensis; clasificado inicialmente como Nocardia X-14868.

A la fecha la maduramicina es el antibiótico de tipo polieter empleado como agente anticoccidia más potente. El antibiótico es efectivo a la dosis de 5 ppm, lo cual resulta ser de 10 a 25 veces más activo que otros antibióticos de tipo polieter empleados para este fin (Cuadro 4) (59-60).

En las dos últimas décadas, la compañía Pfizer ha realizado un intenso trabajo de investigación encaminado a la obtención de antibióticos de tipo polieter derivados de microorganismos del género Actinomadura. En este marco destaca el descubrimiento del antibiótico UK-58, 852 83 (Fig. 3). Este producto fue aislado de un cultivo de A. roseorufa (ATCC 39697) y presentó actividad anticoccidia contra cinco especies de Eimeria a la dosis de 20 ppm (88) Sin embargo, el producto fue poco tolerado por los animales utilizados en las distintas pruebas.

Con la finalidad de incrementar la potencia o el índice terapéutico del antibiótico 83, Glazer y colaboradores (28) evaluaron la actividad anticoccidia y la tolerancia de diferentes derivados semisintéticos de UK-58,852 (ATCC 39697) en aves. Estos análogos de mayor polaridad, se eliminaron con mayor facilidad y fueron mejor tolerados por los animales de prueba. Los resultados arrojados por esta investigación permitieron la obtención de un producto con mejores propiedades farmacológicas, la semduramicina (UK-61,689; 93). En este último antibiótico el azúcar del anillo A de UK-58,852 se reemplazó por un grupo hidroxilo (Fig. 3). La semduramicina se obtuvo también de manera eficiente mediante la hidrólisis de UK-58,852. Sin embargo, los investigadores estaban interesados en producir semduramicina directamente por fermentación. Para ello Glazer y colaboradores (28) obtuvieron una mutante de A. roseorufa (ATCC 39697) en la cual la enzima glucosiltransferasa responsable de la glucosidación en el anillo A (última etapa en la biosíntesis de la semduramicina) se encontraba bloqueada. La cepa mutante productora de semduramicina se obtuvo en dos pasos: en primer lugar se logró la obtención de una mutante parcial que producía semduramicina y UK-58 852 en una relación aproximada de 9:1.

La mutación subsecuente de esta cepa (ATCC 53 664) permitió obtener otra mutante capaz de biosintetizar la semduramicina sin coproducir el antibiótico UK-58, 852. La semduramicina presentó una actividad anticoccidia comparable a la salinomicina y actualmente este producto se comercializa con el nombre de AVIAX.

Durante el desarrollo del programa de mutación encaminado a la obtención de la cepa ATCC 53 664 productora de semduramicina, Dirlam y colaboradores lograron la obtención de tres cepas mutantes (ATCC 53869, ATCC 53870 y la cepa 2634-606) de A. roseorufa (ATCC 53666) productoras de tres antibióticos de tipo polieter novedosos relacionados a la semduramicina y a UK 58, 852. Estos productos fueron denominados CP-91, 243 (95), CP-91, 244 ( 96) y CP-120, 509 (97) (Fig. 3) (17, 21).

En el producto 95, los sustituyentes del azúcar de los anillos A y E en las posiciones 4' y 4'' son dos grupos hidroxilo en lugar de los grupos metoxilo de UK-58, 852. En el caso del producto 96 el grupo metoxilo en C-4' de UK-58, 852 se encuentra sustituido por un grupo hidroxilo. Por otro lado, el compuesto 97 se diferencia de la semduramicina en que el metilo de la posición 30 se encuentra sustituído por un grupo hidroximetileno. Los antibióticos 95 y 96 demostraron actividad anticoccidia contra Eimeria tenella a 60 ppm y 25 ppm, respectivamente. Por otro lado CP-120, 509 (97) fue activo contra Eimeria acervulina a dosis en el intervalo de 30 y 60 ppm (17, 21).

Por último, resulta interesante indicar que algunas especies del género Actinomadura han sido empleadas como un sistema de biotransformación de productos naturales. Tal es el caso de la biotransformación de compactina (98) a pravastatina (99) (Fig. 4) por la especie Actinomadura sp. 2966 (83).

La compactina (mevastatina) y la pravastatina aisladas de hongos filamentosos son inhibidores de la enzima 3-hidroxi-3-metilglutaril reductasa involucrada en la síntesis del colesterol (23, 45). La pravastatina se emplea clínicamente en el tratamiento de la hipercolesterolemia (102). Este producto se obtiene por la hidroxilación de la compactina mediante la inducción de la actividad enzimática de hidroxilasas de origen microbiano. Peng y colaboradores (83) reportaron la conversión de compactina a pravastatina por Actinomadura sp. 2966. El experimento consistió en adicionar a un cultivo de dos días una concentración determinada de compactina y continuar la incubación por uno a siete días. El grado de conversión se determinó calculando el porcentaje de compactina consumida y la cantidad de pravastatina producida. La biotransformación de compactina a pravastatina por Actinomadura sp. 2966 no requiere de inducción y es del orden de 65 a 88 % dependiendo de la concentración de la compactina y de la duración del experimento. Los mejores resultados se lograron cuando la compactina se agregaba en forma intermitente.

Actinomadura MIV2B(31) como una nueva fuente productora de maduramicina (80).

El actinomiceto MIV2B(31) se caracterizó como un microorganismo aerobio, gram positivo que presenta un micelio aereo ramificado y cadenas de esporas de igual tamaño (1mm). El análisis de los hidrolizados celulares de este microorganismo permitió identificar al meso-DAP, la galactosa y la madurosa como los marcadores químicos mayoritarios. El actinomiceto MIV2B(31) tiene la propiedad de hidrolizar la caseína y la xantina.

Los porcentajes de identidad y similaridad calculados a partir de la comparación de las secuencia del fragmento de ADNr 16 S (544 pares de bases) del actinomiceto MIV2B(31) con las depositadas en la base de datos del GenBank (Cuadro 5) indican que este microorganismo podría correlacionar con las especies Pseudonocardiaceae Str.PA151, (99.491% similaridad), Actinomadura madurae (99.445 % similaridad), Actinomadura yumaensis (99.389 % de similaridad), o Actinomadura formosensis (99.202 % de similaridad). Estos resultados aunados a los obtenidos de los experimentos de tipo quimiotaxonómico permiten proponer que el actinomiceto MIV2B(31) pertenece al género Actinomadura. Aparentemente, el actinomiceto MIV2B(31) es diferente a la especie Actinomadura yumaensis reportada previamente como único organismo productor de la maduramicina (31).

Como parte de un programa de investigación encaminado a la búsqueda de agentes herbicidas de origen natural se identificó al actinomiceto MIV2B(31) como una fuente potencial de fitotóxinas. El extracto orgánico preparado a partir del cultivo de este microorganismo inhibió el crecimiento radicular de semillas de Amaranthus hypochondriacus (CI50 58.41 mg/ml) y la síntesis de ATP en cloroplastos aislados de espinaca (87.5 %, 500 mg/ml) (33).

El estudio químico biodirigido del extracto activo (8.66 g) del actinomioceto MIV2B(31) permitió el aislamiento de la maduramicina (80). Este antibiótico se caracterizo mediante métodos espectroscópicos, espectrométricos y mediante cristalografía de rayos X. En la Fig. 5 se presenta una vista estereoscópica de la sal de sodio de la maduramicina.

Efecto de la maduramicina sobre el crecimiento vegetal.

1. Determinación del efecto de la maduramicina (80) sobre la germinación y el crecimiento radicular de diversas semillas de prueba.

Los resultados derivados de la evaluación del efecto de la maduramicina sobre tres especies vegetales nocivas (Amaranthus hypochondriacus, Echinocloa crusgalli y Trifolium alexandrinum) y dos especies cultivables (Phaseolus aureus y Tritricum vulgare) indicaron que el antibiótico inhibe la germinación de las semillas A. hypochondriacus, E. crusgalli y T. alexandrinum a una concentración de 500 μM. Las especies P. aureus y T. vulgare fueron menos sensibles al tratamiento. Por otro lado, el crecimiento radicular de todas las semillas de prueba se inhibió por el tratamiento con diferentes concentraciones del antibiótico. Los valores de la concentración inhibidora media (CI50) del crecimiento radicular de la maduramicina calculados para cada una de las semillas de prueba (Cuadro 6) indican que las semillas de las especies nocivas de A. hypochondriacus, E. crusgalli y T. alexandrinum fueron las más afectadas. Es importante indicar que el efecto de la maduramicina sobre A. hypochondriacus y E. crusgalli fue comparable al del herbicida comercial 2, 4-D (ácido 2,4-diclorofenoxiacético). Por otro lado, las semillas de T. vulgare y P. aureus fueron un orden de magnitud menos sensibles a la maduramicina indicando así un cierto grado de selectividad sobre las semillas de especies nocivas con respecto a las semillas de las especies cultivables (32).

2. Determinación del efecto de la maduramicina (80) sobre la producción de biomasa de especies vegetales selectas.

La evaluación de la actividad fitotóxica postemergente in vivo se realizó mediante la determinación del efecto de la aplicación foliar de una solución de concentración 10 -4 M de maduramicina sobre dos especies cultivables: Phaseolus aureus (Leguminoseae) y Triticum vulgare (Graminaceae) y dos especies nocivas: Trifolium alexandrinum (Leguminosae) y Echinocloa crusgalli (Graminaceae).

Los resultados representados en la Fig. 6 indican que la maduramicina reduce el peso fresco y la longitud de la plantula de las especies T. alexandrinum, T. vulgare y P. aureus. La especie T. vulgare fue la especie más susceptible. El crecimiento de la plantula se redujo en un 42.2 % y el peso fresco en un 54.6%. En el caso de P. aureus, los porcentajes de inhibición de la longitud de la plantula y del peso fresco fueron de 21.0% y 36.8%, respectivamente. Es importante hacer notar que el efecto del antibiótico sobre estas especies es comparable o mayor que efecto del control positivo (paraquat 10 -4 M). Por el contrario, la especie E. crusgalli fue más resistente al tratamiento. En el caso de las especies T. alexandrinum y P. aureus se observó además necrosis, clorosis, desecación y ruptura de las hojas después del tratamiento (32).

3. Determinación del efecto de la maduramicina (80), del éster metílico de la maduramicina (100) y la monesina (101) sobre diversas actividades fotosintéticas asociadas a la fase luminosa en cloroplastos aislados de espinaca

La maduramicina (80), el éster metílico de la maduramicina (100) y la monesina (101) (Fig. 7) inhiben de manera dependiente de la concentración la fotofosforilación y la captación de protones de agua a metilviológeno en cloroplastos aislados de espinaca (Cuadro 7, Fig. 8). Los valores de la concentración inhibitora media de los antibióticos para la síntesis de ATP y la captación de protones se resumen en el Cuadro 7.

El transporte de electrones no cíclico de agua a metilviológeno en condiciones basal y fosforilante se estimulan por adición de diferentes concentraciones de los tres antibióticos, por el contrario el transporte de electrones desacoplado no fue afectado (Fig. 9).

Los antibióticos 80, 100 y 101 estimulan la actividad de la enzima Mg 2+-ATPasa. La magnitud del efecto estimulante es alrededor del 300% con respecto al control.

La actividad inhibidora de la maduramicina (80) y su derivado metilado ( 100) sobre la síntesis de ATP y la captación de protones, el efecto estimulante en el transporte de electrones basal y fosforilante, así como la activación de la enzima Mg2+-ATPasa indican que este compuesto se comporta como un desacoplante clásico en los cloroplastos.

Los valores de la concentración inhibidora media de la síntesis de ATP (Cuadro 8) indican que el éster metílico de la maduramicina es cuatro veces más potente como agente desacoplante que el producto natural. Este efecto podría ser explicado por un aumento en la lipofilia de la molécula por la introducción del grupo metilo; hecho que incrementa la difusión del derivado metilado a través de la membrana tilacoidal.

Los resultados encontrados constituyen la primera demostración de que los antibióticos de tipo polieter no afectan el transporte de electrones desacoplado y en consecuencia de que no afectan directamente la cadena trasnportadora de electrones durante la fotosíntesis. También se demuestra por vez primera el efecto estimulante de la actividad de la enzima Mg 2+-ATPasa. En estudios anteriores Shavit y colaboradores (99, 100) demostraron el efecto desacoplante en cloroplastos de los antibióticos monesina (utilizado como control en este estudio), lasalocida A, antibiótico X-206, y dianemicina. En estos estudios se evaluó el efecto de los antibióticos sobre la síntesis de ATP y la captación de protones y la magnitud del efecto fue comparable al desarrollado por la maduramicina.

El mecanismo propuesto para el efecto desacoplante en cloroplastos de estos productos es la disipación del gradiente electroquímico vía intercambio de catión/H+ mediante el transporte de estos iones a través de las membranas biológicas. La capacidad ionófora de estas moléculas depende de que adopten una conformación pseudociclíca de naturaleza hidrofóbica. Esta conformación pseudocíclica se logra mediante la formación de un puente de hidrógeno entre el hidrógeno de un hidroxilo de un extremo de la molécula y los pares de electrones libres del oxígeno del carbonilo del otro extremo de la molécula (Fig. 5). Los oxígenos de los anillos tetrahidrofurano y tetrahidropirano complejan al cation y este a su vez neutraliza la carga negativa del carboxilato. Este elegante diseño molecular proporciona a los antibióticos de tipo polieter la conformación necesaria para conducir cationes a través de las membranas biológicas disminuyendo así el gradiente electroquímico por un mecanismo de difusión pasiva (99, 100).

Los resultados del efecto de la maduramicina sobre la germinación y crecimiento radicular de las semillas de prueba, sobre la producción de biomasa de especies vegetales selectas así como el efecto desacoplante en los cloroplastos aislados de espinacas permiten establecer que la maduramicina posee propiedades inhibidoras del crecimiento vegetal de tipo pre y post emergente. La magnitud de los efectos fitotóxicos que desarrollo la maduramicina en las distintas pruebas realizadas en esta investigación, comparable a la de productos de uso comercial, hacen de este compuesto un candidato aceptable para el desarrollo de nuevos herbicidas. Sin embargo, las propiedades ionofóricas del antibiótico podrían limitar el impulso del mismo.

Ante la demostración del efecto fitotóxico de la maduramicina es altamente probable que la eliminación via excreta de este producto por los animales de granja tratados con el antibiótico podrían tener efectos no deseables sobre el crecimiento vegetal de especies silvestres y cultivables. Las investigaciones relacionadas al metabolismo de la maduramicina en aves y roedores indican que la mayor parte del producto se excreta sin metabolizar, aunque también se han identificado metabolitos producto de la O-desmetilación de uno o más grupos metoxilo, de la hidroxilación y de la conjugación con el ácido glucorónido (10, 103, 104).










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