María Valdés, Néstor Octavio Pérez, Luis Vásquez

Escuela Nacional de Ciencias Biológicas del Instituto Politécnico Nacional, Prolongación de Carpio y Plan de Ayala s/n, 11340, México D. F.

Introducción

Frankia es una bacteria filamentosa o actinomiceto, fijadora de nitrógeno, que cuando vive en asociación con ciertas plantas, induce en sus raíces la formación de nódulos fijadores de nitrógeno.

Los beneficios de esta simbiosis se conocen desde hace muchos años y ya desde 1886 se suponía que el endofito de estas plantas era microbiano (47). Se han encontrado evidencias fósiles del Pleistoceno del árbol aile o aliso cuyos nódulos albergaban actinomicetos en su interior (6). Sin embargo no fué sino hasta 1978 en que el grupo del Dr. Torrey, en la Universidad de Harvard (19), logró aislar y hacer cultivos puros del actinomiceto Frankia.

La simbiosis formada por la bacteria Frankia y el nódulo radical de la planta se conoce con el término de actinorriza. Se han descrito en la actualidad alrededor de 200 especies de angiospermas, llamadas Plantas Actinorrízicas, distribuídas en ocho familias botánicas, que son portadoras de nódulos radicales fijadores de nitrógeno formados por Frankia. El hecho de que esta bacteria filamentosa haga simbiosis con miembros de varias familias, muestra una de las grandes diferencias que existen entre ella y la otra bacteria simbiótica fijadora de nitrógeno, Rhizobium, cuyos géneros hospederos pertenecen en su mayoría a la familia de las leguminosas.

La capacidad de adaptación de las plantas actinorrízicas a suelos marginales seguramente está relacionada no solo a su capacidad de autoabastecerse de nitrógeno a través de su simbiosis con Frankia, sino también a que se asocian con hongos endo y ectomicorrízicos (Fig. 1), simbiosis que las provee de muchos nutrientes, sobretodo de fósforo. Algunas de estas plantas responden a la falta de fósforo en el suelo con la formación de raíces protoides o raíces en racimo (79,42), lo que les permite captar mas eficientemente el poco fósforo disponible en el suelo.

Este tipo de raíces se llaman proteoides porque fueron observadas por primera vez en la familia Proteaceae y posteriormente han sido observadas también en las leguminosas y en las plantas actinorrízicas. Se trata de grupos densos de raicillas de la misma longitud que producen gran cantidad de pelos y ocurren en intervalos a lo largo de las raíces laterales dando la impresión de ser un cepillón de botellas (Fig. 2).

En resumen, las plantas actinorrízicas son capaces de formar varias y diferentes asociaciones con microorganismos del suelo (Fig 3).

Esta revisión debe enfocar la bacteria Frankia, su morfología, su fisiología, su genética y ecología. Sin embargo, no nos parece que esté de mas conocer un poco a las plantas que la alojan en sus raíces, ya que hemos escuchado poco de ellas. Quizá el lector se anime a buscar en las altiplanicies de los países tropicales otras plantas que no han sido descritas como actinorrízicas, como nosotros, que tuvimos esta emocionante experiencia (27). Es en los países templados donde se han hecho la mayoría de las exploraciones. Esperemos que al conocer este recurso natural, también podamos motivar a los estudiantes a estudiar la bacteria.

Las plantas hospederas

Las plantas actinorrízicas son arbustos o árboles que habitan muy diversos ecosistemas (Tabla 1) y se adaptan a condiciones ambientales extremas como suelos salinos, terrenos pantanosos y ambientes polares. Todas estas plantas tienen en común que son de rápido crecimiento y una gran capacidad de crecer en suelos de baja fertilidad o después de algún disturbio (como erupciones volcánicas e incendios), y son frecuentemente las pioneras en el desarrollo de la sucesion de la comunidad vegetal (82).

Ninguna de las especies hospederas de Frankia son plantas de interés agrícolas; estas plantas tienen importancia económica como productoras de madera y de leña, son de interés silvícola, recuperación de terrenos y algunas en jardinería. Aunque no se conocen usos agrícolas de estas plantas, los frutos de algunas de ellas son de consumo humano en Europa como es el mirto de mar (Hippophäe rhamnoides ), cuyos frutos son ricos en vitamina C, E y F, carotenos, y los actualmente muy mencionados ácidos omega 3 y omega 6 (ácidos linoleíco y linolénico); con estos frutos se prepara cidra, cerveza y jaleas (97).

Las plantas actinorrízicas son principalmente templadas, a diferencia de las leguminosas que son en su mayoría y originalmente del trópico. Muchas de estas plantas son muy importantes en países de latitud alta donde las condiciones no son favorables para las leguminosas y sí para las actinorrízicas permitiéndoles un crecimiento vigoroso. En los períodos glacial y post-glacial fueron muy abundantes en América del Norte y en Europa donde colonizaron los depósitos glaciales pobres en nitrógeno y aceleraron el desarrollo del suelo con incorporación de materia orgánica rica en nitrógeno (82).

El significado de la simbiosis actinorrízica es su valor ecológico, no solo porque son plantas que se adapten a los suelos empobrecidos y a ambientes extremos o porque sean especies pioneras, sino porque además, esta simbiosis tiene un papel ecológico en el balance global del nitrógeno e incrementa la productividad de muchas comunidades vegetales vecinas.

Utilizando los mismos métodos de medición, las cantidades de nitrógeno fijado por estas plantas usualmente son mas grandes o comparables con las cantidades fijadas por las leguminosas (92); se considera que las tasas de acumulación anual de nitrógeno van de 60 a 320 kg/ha/año en plantaciones de aile (20).

El incremento de la productividad de los sitios en las comunidades de plantas vecinas se explica por diferentes razones:

1) se incorpora nitrógeno al suelo a través de hojarasca que cae al mismo

2) se transfiere parte del nitrógeno que ellas fijan hacia las plantas vecinas (30) a través de la red subterránea de hifas de la ectomicorriza que va de unas plantas a otras (31)

3) el nitrógeno orgánico se mineraliza rápidamente en las plantaciones donde hay plantas actinorrízicas; la cantidad de nitrógeno mineralizado en las plantaciones de Elaeagnus umbellata llega hasta 236 kg por hectárea en un año (68).

La distribución filogenética de estas plantas entre las angiospermas ha conducido a muchas dudas en cuanto a la evolución de las simbiosis fijadoras de nitrógeno. Cronquist (26) hace el siguiente esquema de clasificación con base en caractéres morfológicos: tres de las familias actinorrízicas (Betulaceae, Casuarinaceae y Myricaceae) se agrupan en la subclase Hamamelidae, otras tres (Elaeagnaceae, Rhamnaceae y Rosaceae) se agrupan en la subclase Rosidae y las otras dos familias (Datiscaceae y Coriariaceae) en otras dos subclases (Dilleniidae y Magnolidae).

Sin embargo, la introducción de la filogenia molecular ha dado resultados muy interesantes y se ha mostrado que las simbiosis rhizobiana y actinorrízicas forman un solo grupo (87) y apoyan un solo origen de la predisposición a la simbiosis. Un estudio más profundo sobre el análisis de secuenciación de nucleótidos del gene del cloroplasto que codifica para la subunidad grande de la ribulosa-1,5-bifosfato carboxilasa/oxigenasa (Rubisco), reafirma que todas las plantas noduladas forman un grupo coherente e indica múltiples orígenes de la simbiosis dentro del grupo (89,90) (Fig. 4).

Finalmente, nos gustaría comentar que un árbol actinorrízico nativo de México, el aile o aliso (Alnus sp.) (Fig. 5) muestra que tiene la potencialidad de ser usado con éxito en restauración ecológica (49), problema que requiere solución urgente en México (y en todo el planeta).

En México otro árbol actinorrízico ha dado buenos frutos, se trata de Casuarina. Esta planta, capaz de crecer en arena, fue introducida para estabilizar los médanos de la costa del Golfo de México (y evitar que el mar le ganara terreno al continente) y como cortina para proteger a las poblaciones cercanas al puerto de Veracruz de la lluvia de arena y sales producida por el arrasador y veloz viento del norte. Es también un árbol capaz de tolerar la adversidad de los ejes viales de la ciudad de México (Fig 6); ha podido crecer y fructificar en esas condiciones.

Los nódulos

Los nódulos actinorrízicos son perennes y tienen forma de estructuras coraloides (Fig. 7a, Fig. 7b) con muchos lóbulos; cada lóbulo es una raíz lateral modificada. El tamaño de los nódulos varía con la planta de la que se trate y es muy común encontrar en el campo nódulos de 3 a 5 cm de diámetro; nosotros encontramos uno de 15 cm en las raíces de Alnus accuminata (Fig. 8).

En los nódulos de las leguminosas el tejido vascular se bifurca rodeando a las células infectadas por Rhizobium, mientras que en los nódulos actinorrízicos el tejido vascular se encuentra en la parte central y, hacia los lados, en el cortex, se encuentran las células que contienen a la bacteria Frankia (Fig. 9). Además de la estructura, también la ontogenia de los nódulos es diferente en las leguminosas; en éstas el primordio del nódulo se forma en el cortex, mientras que en las plantas actinorrízicas se forma en el periciclo, de manera que la bacteria tiene que atravesar casi o todo el cortex de la raíz para llegar a las células nodulares (11).

Los nódulos fijadores de N₂ generalmente se forman y funcionan en las raíces (en el suelo), aunque se han descrito nódulos aéreos formados en el tallo de algunas leguminosas; en algunas plantas actinorrízicas también se han encontrado nódulos caulinares como en Casuarina cunninghamiana (71) y en C. equisetifolia (93).

El desarrollo de una interacción simbiótica involucra cierta diferenciación del microsimbionte o endofito. En el caso de Frankia, su diferenciación depende de la especie de la planta, que determina la morfología de las vesículas (en algunos casos las vesículas no se forman, como en los nódulos de Casuarina), así como su localización en las células infectadas. La planta también determina el sitio de penetración de la bacteria (ya sea por los pelos radicales o intercelularmente), la extensión de la infección y el número de nódulos.

La bacteria

Frankia es un procarionte gram-positivo con hifas o filamentos septados, con una composición de su ADN de 70% de guanina mas citosina. Este alto contenido de G-C está también presente en otros actinomicetos como Geodermatophilus (36); en otras bacterias fijadoras de nitrógeno este nivel es mas bajo (53). Otra gran diferencia con Rhizobium es que Frankia fija nitrogeno in vitro bajo las condiciones normales de presión y temperatura; si bien Azorhizobium también fija N₂ in vitro, es un genero genéticamente muy diferente a los otros miembros de la familia Rhizobiaceae (30a) Son bacterias microaerofílicas cuando utilizan nitrógeno atmosférico (N₂) para crecer y son absolutamente aerobias cuando se les proporciona nitrógeno combinado (NH₃) en el medio de cultivo.

Morfología. Morfológicamente Frankia es un organismo complejo, presenta un crecimiento pleomórfico; crecen en forma de filamentos y, como la mayoría de los actinomicetos, las hifas se diferencian en esporangios (Fig. 10). Estos contienen en su interior gran cantidad de esporas en estado latente que germinan para formar hifas cuando encuentran condiciones ambientales adecuadas. Todavía no se sabe con precisión, cuáles son los factores que influyen en la formación de esporangios ni en la germinación de las esporas.

Las hifas también pueden diferenciarse para formar una estructura que constituye un rasgo sobresaliente de Frankia, la vesícula. Esta estructura está especializada en la fijación de nitrógeno atmosférico. Las vesículas se desarrollan como un hinchamiento de las hifas ramificadas lateralmente, son redondas y de pared gruesa (Fig. 11).

La función de la vesícula es proteger a la nitrogenasa del efecto negativo del O₂. La nitrogenasa está localizada en el interior de las vesículas y es la enzima encargada de la fijación de nitrógeno, es decir, de la transformación del nitrógeno no asimilable por la planta (N₂) a una forma asimilable (NH₃). A mayor concentración de oxígeno en el medio, la pared envolvente también aumenta y las vesículas se evidencian al microscopio con mayor refringencia (Fig. 11).

Las especies de Frankia crecen muy lentamente in vitro, no forman micelio aéreo en medio de cultivo solidificado por lo que se les propaga en medio líquido donde el conjunto de filamentos tiene el aspecto de copos de nieve.

Aislamiento. Para aislar Frankia de los nódulos, los lóbulos de los mismos después de desinfectarse cuidadosamente, se colocan en medio líquido o en medio sólido. En ocasiones, después de un mes de incubación se logra obtener una colonia de unos milímetros; a veces el período de incubación puede ser de 6 meses.

Muy pocas cepas de Frankia son cultivables; aquellas que pueden cultivarse son las más saprofíticas o con requerimientos nutricionales menos estrictos, como son las cepas de las Betuláceas (Alnus). En otros casos, como en Casuarina, la mayoría de las cepas se encuentran dentro de los nódulos radicales y son muy pocas las cultivables (76). De muchas otras plantas como Adolphia, Datisca, Ceanothus, Dryas, hasta la fecha no se ha podido aislar su microsimbionte fijador de nitrógeno.

Taxonomía. La taxonomía del género se debe a Becking (4) quien propuso que el nombre Frankia resurgiera en honor del microbiólogo suizo A. B. Frank, quien acuñó el término simbiosis. El colocó al género en la familia Frankiaceae del orden Actinomycetales. El mismo autor creó 10 especies de acuerdo a la especificidad de Frankia para nodular plantas, según la usanza de los taxonomistas de Rhizobium de esa época. En la actualidad, se aceptan tres grupos de plantas, llamados grupos de especificidad de hospedero (5), Tabla 2. Estos grupos se basan en la especificidad que muestran las cepas cultivables para inducir la formación de nódulos en ciertas plantas.

La validez de estos grupos se han confirmado con técnicas modernas de análisis genético (62). Hay excepciones, como son algunas cepas de Alnus con capacidad de nodular Elaeagnus (17) y las cepas aisladas de Gymnostoma que también nodulan Elaeagnus (59). Entre las plantas, también hay algunas que son poco selectivas en cuanto a su compañero bacteriano y no muestras preferencia por cepas específicas, lo que resulta en que forman nódulos con cepas de Frankia que nodulan otras plantas, como es el caso de Myrica y Gymnostoma.

La bacteria en el suelo. El número de propágulos de Frankia presentes en el suelo está en pequeñas cantidades, lo que limita los tipos de ensayos que se puedan hacer para contar la bacteria en el suelo. Además, su aislamiento directo del suelo es muy difícil, de hecho solo ha sido reportado una sola vez (7). Su presencia en el suelo ha sido comprobada y cuantificada a través de bioensayos utilizando plantas hospederas y verificando su nodulación, su número va de 0-4600 unidades de nodulación/gr de suelo.

En cuanto a estudios ecológicos de poblaciones de Frankia, es importante considerar para ello las dificultades en su aislamiento y su lento crecimiento, por lo tanto es necesario obviarse la etapa del asilamiento. Afortunadamente se ha avanzado mucho en los métodos moleculares, los que proveen una vía alternativa para medir cuantitativamente las poblaciones de Frankia en el suelo en forma precisa y reproducible. La amplificación específica de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) tanto en su modalidad anidada (nested) como reforzada (booster) son muy sensibles, con un potencial de detección de una sola unidad génica/gr de suelo (56). Así mismo, la técnica de PCR del ADN extraído directamente del suelo e hibridado posteriormente con sondas específicas muestra ser una herramienta excelente para estudios de distribución de la población en el suelo (58). Hay que enfatizar en el hecho de que estas técnicas tienen limitaciones en la práctica según la pureza del ADN extraído del suelo y por las substancias inhibitorias del mismo.

En relación a otro estudios ecológicos, también se ha desarrollado métodos moleculares para estudiar directamente en el interior del nódulo la presencia de ciertas cepas de Frankia , tanto aquellas cultivables , como las no cultivables. Para ello se han diseñado, al igual que en el caso anterior, sondas género específicas e incluso de algunos tipos genéticos de cepas (38, 85, 57). Este punto lo tratamos ampliamente adelante, en la sección de genética.

Genética de Frankia

Entre los propósitos de estudiar la genética de Frankia, como la de cualquier otro microorganismo, está conocer su diversidad y su filogenia, y en su caso particular entender a un nivel molecular las interacciones que se dan entre este actinomiceto simbionte y sus hospederos, además de contar con herramientas para su estudio ecológico.

Este actinomiceto además de ser difícil para cultivar, también es difícil para ser modificado genéticamente. Hasta la fecha no ha sido posible obtener mutantes, lo cual ha impedido conocer la función de muchos de sus genes. Además no se ha logrado introducir ADN ajeno a su genoma, lo que ha impedido su manipulación genética. Este hecho ha encontrado una explicación en los hallazgos de Tavares y Sellstedt (91) quienes demostraron que Frankia produce una gran cantidad de enzimas que degradan al ADN (ADNasas), impidiendo de esta forma la incorporación de ADN extraño. Por estas razones los estudios genéticos en esta bacteria se han tenido que desarrollar comparándola con otros microorganismos. Como Frankia es un simbionte fijador de nitrógeno y formador de nódulos, se ha comparado con Rhizobium y como es actinomiceto se compara con Streptomyces.

De esta forma se han descrito genes muy importantes. La mayoría de ellos involucrados en la fijación de nitrógeno o en el proceso simbiótico. Así, esta parte de la revisión se enfocará a la descripción de dichos genes y el impacto que han tenido para describir la diversidad y la filogenia de Frankia.

Genes ribosomales. Estos genes codifican para el ARN ribosomal (rARN), el cual se ensambla con proteínas para formar los ribosomas, organelos celulares involucrados en la síntesis de proteínas. Se dice que entre más copias de este gene existan más rápido crece un microorganismo. Así por ejemplo, Escherichia coli tiene 6 copias de sus genes ribosomales y se duplica cada 20 min; en cambio, Frankia tiene solo dos copias (65, 70) (Fig. 12) y se duplica cada 5 días.

La secuencia de los genes ribosomales define a cada microorganismo. Es decir, el orden de las nucleotidos que forman dichos genes es para los microorganismos, lo que las huellas digitales es para los humanos. Conocer la secuencia de estos genes permitió construir el árbol genealógico de todos los seres vivos (98).

Existen tres genes ribosomales, cada uno tiene diferente tamaño y en procariotes se conocen como 23S, 16S y 5S. En el genero Frankia estos genes muestran la estructura de cualquier bacteria, 16S-23S-5S, (65) y presenta dos espacios intergénicos (Fig 13). Estos espacios son fragmentos de ADN que no codifican para ningún gene, esto hace que las mutaciones en el ADN se fijen con mayor frecuencia que en los genes codificantes, sirviendo de esta forma como un reloj molecular que nos permite diferenciar cepas muy emparentadas. El uso de estos fragmentos de ADN se discutirá mas adelante.

Genes simbióticos. Como se mencionó anteriormente existen grandes similitudes entre las simbiosis entre Frankia y las plantas actinorrízicas y Rhizobium-leguminosas, sobre todo en el proceso de infección y la fijación de nitrógeno (revisado en Pawlowski y Bisseling [69]). Estos estudios comparativos se han enfocado principalmente a dos grupos de genes, los genes nod y los genes nif.

a) Genes nod. Sin lugar a dudas existen grandes similitudes entre los procesos de infección de las simbiosis Frankia-plantas actinorrízicas y Rhizobium-leguminosas, lo cual sugiere la existencia de analogías entre ambos procesos. El primer reconocimiento entre Rhizobium y las leguminosas se lleva a cabo mediante la liberación de algunos compuestos conocidos como flavonoides por la planta (40). Algunos estudios sugieren que esto puede ocurrir también en la simbiosis actinorrízica (14).

Los flavonoides de la planta activan varios grupos de genes de los microorganismos, que al expresarse hacen posible la nodulación. Un grupo de estos genes es conocido como nod (genes de nodulación). Varios investigadores han tratado de utilizar genes nod provenientes de Rhizobium y Bradyrhizobium como sondas para encontrar genes homólogos en Frankia. Los resultados han sido poco alentadores (53). Otros investigadores han intentado complementar mutantes nod- de Rhizobium con ADN de Frankia, los resultados tampoco han sido positivos (72, 22).

Los genes nod de Rhizobium son los responsables de la síntesis de una molécula conocida como factor nod. Este factor cuando es aplicado a las raíces de las leguminosas provoca deformación en los pelos de la raíz. Se sabe de la existencia de un factor deformante de pelos radicales de plantas actinorrízicas en el sobrenadante de cultivos de Frankia (52), tal como ocurre con Rhizobium. Recientemente se ha estudiado la naturaleza de este factor deformante y se ha comprobado que es diferente al de Rhizobium (23). Aún no se ha descrito con exactitud la naturaleza química de este factor deformante, ni los genes que están involucrados en su expresión. Todavía queda mucho por descubrir en esta simbiosis, especialmente en lo referente a sus genes de nodulación.

b) Los genes de la nitrogenasa. Una de las características más importantes de Frankia es su capacidad de fijar nitrógeno tanto in vivo como in vitro. La fijación biológica de nitrógeno es un fenómeno que se lleva a cabo exclusivamente en procariotes. Este proceso consiste en la reducción del nitrógeno atmosférico (N₂) a amoníaco (NH₃) mediante la acción de una enzima conocida como nitrogenasa. La síntesis de esta enzima esta codificada por tres genes llamados nifHDK, los cuales están localizados en un operón.

Como los ensayos para desarrollar métodos de mutación en Frankia no han tenido éxito y tampoco se han encontrado vectores de expresión adecuados, la localización de los genes nif en Frankia se logró a través de hibridaciones heterólogas con genes de otros microorganismos diazotróficos (84). Así fueron localizados y secuenciado estos genes estructurales de la nitrogenasa; el gene nifH (63, 44), el gene nifD (66, 44) y el gene nifK(41).

Se ha estudiado muy a fondo la organización del operon nifHDK en Frankia (Fig. 14) y se ha observado la presencia de dos espacios intergénicos como los que hay entre los genes ribosomales. En la mayoría de las cepas de Frankia estos genes están contiguos y codificados en el cromosoma, (63), a diferencia de Rhizobium, cuyos genes nif están en un gran plásmido.

El análisis de las secuencias del gen nifH de Frankia ha revelado que este gen se parece más al gen nifH de la cianobacteria Anabaena que a los genes nif de otros fijadores Gram positivos como Clostridium o Paenibacillus (63). Esto apoyaría la hipótesis de que estos genes se han transmitido horizontalmente y no verticalmente de un ancestro común (64, 41).

La presencia de los genes nif se considera un rasgo diagnóstico del género Frankia (46) y basados en las secuencias obtenidas se han diseñado algunos iniciadores Frankia específicos para detectar este gen por la técnica de la PCR (86, 96), permitiéndonos identificar específicamente a Frankia en muestras de suelo o nódulos.

Los espacios intergénicos (IGS). Como se mencionó anteriormente los espacios o segmentos intergénicos de Frankia han recibido gran atención. Debido a que son relojes moleculares que caminan más rápido que los basados en genes, permiten la diferenciación de los individuos hasta el nivel de cepa. Con el análisis de genes en muchas ocasiones no es posible diferenciar entre cepas muy relacionadas.

El espacio entre los genes 16S y 23S (Fig. 12) ha sido usado para estudiar la diversidad genética de cepas de Frankia aisladas y no aisladas de Casuarinaceas (75, 76, 70, 34) y se ha podido demostrar que las cepas capaces de nodular Gymnostoma (Casuarinaceae) son cepas nodulantes de Elaeagnaceas (59, 34), también ha servido para demostrar co-infección (doble infección) en nódulos de Casuarina collina con cepas compatibles entre Casuarina y Elaeagnus (33). Estos estudios se han extendido a cepas provenientes de muchas otras plantas actinorrízicas, incluyendo aislados pertenecientes a muy diversos grupos genómicos (50, 73).

Los genes nifHDK de Frankia también presentan dos espacios intergénicos, lo que ha permitido desarrollar métodos que permiten el análisis de estas regiones tan variables (43, 75). Así mismo, se han diseñado iniciadores género específicos (57) y se ha encontrado que este espacio es más variable que el espacio ribosomal (50).

Este tipo de estudios ha demostrado una alta variabilidad genética dentro del género Frankia, especialmente entre los aislados de Alnus y Elaeagnus y curiosamente una baja diversidad entre los aislados de Casuarina. Estos estudios han sido utilizados también para hacer estudios de tipo ecológico junto con otras herramientas que se explicarán enseguida.

Marcadores Frankia específicos. Una de las grandes retos de los ecólogos microbianos es conocer el comportamiento de los microorganismos a través del tiempo y el espacio. En este caso en particular, es muy importante desarrollar técnicas que nos permitan identificar rápidamente a una cepa de Frankia. Imaginen que deseamos saber si una cepa de Frankia es capaz de sobrevivir en un nuevo hábitat. Si siguiéramos los métodos clásicos de la ecología microbiana, tendríamos que reaislarlo del hábitat al cual lo hemos introducido, ¡esto podría llevarnos meses!. Por ello se han desarrollado algunos métodos moleculares que nos permiten seguir a Frankia en el suelo o en los nódulos, ahorrándonos los pasos del aislamiento y el cultivo.

El análisis de las secuencias de los genes nif y ribosomales ha permitido la utilización de secuencias de ADN complementarias a ciertas regiones específicas del genoma de Frankia. Estas secuencias conocidas como sondas son marcadas para su detección, ya sea con radioactividad o con fluorescencia. Estas sondas han sido utilizadas para diferenciar cepas de Frankia dentro de los nódulos de árboles que han sido inoculados con varias cepas para estudiar la competencia entre ellas (85, 37), para localizar a Frankia en el suelo (38) y para detectar in situ las hifas de Frankia usando fluorescencia (39). Estas técnicas han demostrado ser muy poderosas para diferenciar cepas y han sido usadas para estudiar poblaciones de Frankia bajo diferentes condiciones ambientales (61).

Otra técnica que nos permite diferenciar entre una cepa y otra es la conocida como rep-PCR. Estos elementos son secuencias palíndromes, cortas, intergénicas que se repiten y están muy conservadas y generan una huella digital genética que es especifica para cada microorganismo, permitiéndonos diferenciar entre una cepa y otra. Murry et al (54) reportaron la utilidad de esta técnica para diferenciar cepas de Frankia, y posteriormente ha sido utilizada para estudiar cepas dentro de los nódulos de plantas actinorrízicas de las cuales no ha sido posible aislar al actinomiceto (55, 88). Con este método también ha sido posible diferenciar cepas de Casuarina que por otros métodos no había sido posible (70).

Diversidad genética de Frankia. El primer aislamiento de Frankia en 1978 dio la pauta para que se aislaran cepas de Frankia de muchas otras plantas actinorrízicas. Con las cepas aisladas, recordemos que se hicieron pruebas de su capacidad de inducir la formación de nódulos en las plantas, lo que condujo a la formación de tres grupos de bacterias, llamados grupos de especificidad de hospedero (o HSG, por sus siglas en inglés) (5).

Posteriormente, Fernandez et al (32), propusieron una nueva clasificación con base en el parecido del genoma de una bacteria con otra (homología ADN/ADN total). Así, se formaron 9 grupos genómicos de Frankia, que coinciden con los grupos de especificidad de hospedero. Los grupos genómicos 1, 2 y 3 contienen cepas del grupo de Alnus (HSG 1). Los grupos genómicos 4, 5, 6, 7 y 8 contienen cepas del grupo de Elaeagnus (HSG 3), mientras que el grupo genómico 9 contiene únicamente cepas de Casuarinaceae (HSG 2), (Fig. 15).

Beyazova y Lechevalier (16) cortaron el ADN de muchas cepas de Frankia con enzimas (endonucleasas) en segmentos muy grandes (perfiles de macrorestricción). Al analizar los datos se formaron grupos que coincidieron en un 73% con los reportados por Fernandez et al (32).

Estudios más recientes hechos con base en las secuencias de ADN de las Frankiae presentes en los nódulos actinorrízicos han revelado que en la naturaleza existe una mayor diversidad que la detectada en los microorganismos cuando se estudian cultivados.. Este es uno de los motivos por los que a últimas fechas se han investigado las secuencias de ADN pertenecientes a las bacterias dentro de los nódulos actinorrízicos (12). La mayoría de estos estudios incluyen cepas de plantas actinorrízicas poco estudiadas como Ceanothus (74), Coriaria, Discaria, Purshia (12), Colletia, Elaeagnus, Talguenea y Trevoa (24) y diferentes especies de Myricaceas (25). Los datos obtenidos en estos estudios, junto con los de Normand et al (67) han permitido establecer las relaciones que existen dentro de los miembros del género Frankia , como se explicará en el siguiente apartado.

Posición filogenética de Frankia. Una de las preguntas que frecuentemente nos hacemos y que quisiéramos poder contestar es ¿Qué relación tiene este microorganismo con otros?, es decir, ¿Cuál es la filogenia de este microorganismo?. El estudiar la filogenia de Frankia nos permite saber que relación tiene este microorganismo con otros y sobretodo conocer el parentesco que tienen entre sí estos actinomicetos capaces de establecer simbiosis con plantas tan disímiles pertenecientes a ocho familias botánicas diferentes.

La primera clasificación de Frankia fue hecha con base en el tipo de esporangios que presenta este actinomiceto, así junto con los géneros Geodermatophilus y Dermatophilus formaba la familia Frankiaceae (47). Esta primera clasificación morfológica no coincidió con su identificación genética hecha posteriormente con base en el análisis parcial de la secuencia nucleótidica del gen ribosomal 16S de una cepa aislada de Alnus. Este estudio reveló una cercanía entre Frankia, Geodermatophilus y con una bacteria del Mar Muerto conocida como "Blastococcus" pero no con Dermatophilus, proponiéndose la exclusión de este último de la familia Frankiaceae (36). Posteriormente el análisis de un mayor número de secuencias de este mismo gene demostró que dentro del genero Frankia existen 4 grupos (67), concepto actualmente aceptado (48, 25), a saber:

Grupo 1: cepas infectivas en Myrica (Myricaceae), Alnus (Betulaceae), Casuarina y Allocasuarina (Casuarinaceae).

Grupo 2: cepas no cultivables presentes en nódulos de Rosaceae, Coriariaceae y Datiscaceae

Grupo 3: cepas de Eleagnaceas y Gymnostoma (Casuarinaceae).

Grupo 4: cepas aisladas de nódulos de diversas plantas que nodulan (pero son nif -) o no Alnus.

En uno de estos estudios con base en la secuencia del gen ribosomal 16S, el actinomiceto más cercano a Frankia fue Acidothermus cellulolyticus (67). Recientemente otro análisis filogenético con base en el gen recA, que esta involucrado en la reparación del ADN, ha comprobado la relación cercana entre Frankia y Acidothermus (51). Acidothermus cellulolyticus, es un microorganismo celulolítico de aguas termales que tiene un gran contenido de hopanoides, al igual que Frankia. Los autores proponen que ambos actinomicetos tuvieron un ancestro común, rico en hopanoides que quizá fijaba nitrógeno y que posteriormente ambos tomaron direcciones divergentes, transformándose en microorganismos totalmente diferentes.

Fisiología y Bioquímica de Frankia

Pared celular y química celular. La química celular juega un papel prominente en la taxonomía de los actinomicetos al nivel de género. Los compuestos más importantes incluyen: aminoácidos, aminoazúcares y azúcares presentes en la pared celular, polisacáridos unidos no covalentemente a la pared celular, ácidos grasos, fosfolípidos y menaquinonas.

El género Frankia posee una pared celular tipo III que es la más común entre los actinomicetos, constituída fundamentalmente por ácido meso-diaminopimélico, ácido glutámico, alanina, glucosamina y ácido murámico (35, 46).

Con relación al patrón de azúcares presentes en el género Frankia, se observa que es variable y depende de cada cepa. Algunas cepas presentan el patrón tipo D (constituído de xilosa y arabinosa), otras el tipo E (constituido de fucosa), algunas otras presentan el patrón B (con madurosa) y otras tantas poseen el tipo C (con galactosa y glucosa) (77, 46).

Los fosfolípidos característicos del género son: fosfatidilinositol, fosfatidilinositol manósidos y difosfatidilglicerol (patrón tipo PI). Las menaquinona predominante es la MK-9 (46).

Sideróforos. La quelación es un fenómeno rutinario en los sistemas biológicos y consiste en la formación de complejos moleculares en donde participa un agente quelante (molécula que atrapa) y un elemento quelatado (elemento atrapado). Un ejemplo en el suelo, lo constituyen las estructuras moleculares complejas denominadas como arcillas, que funcionan como agentes quelantes que atrapan o liberan iones dependiendo de las condiciones imperantes en el mismo, afectando esto la disponibilidad de iones para la nutrición de microorganismos y plantas.

Los sideróforos son agentes quelantes producidos por diferentes microorganismos en el suelo; los microorganismos fijadores de nitrógeno producen sideróforos para obtener el hierro necesario para llevar a cabo la fijación de este elemento. Recordemos que la enzima nitrogenasa está compuesta de varios componentes protéicos y que 36 átomos de Fe se requieren para su correcto funcionamiento. Se ha observado en algunas cepas de Frankia que nodulan casuarina, la presencia de sideróforos que forman parte de un mecanismo inducible de abastecimiento de hierro cuando el microorganismo se desarrolla en condiciones limitantes de este mineral (3, 18).

Hasta la fecha se han detectado dos tipos de sideróforos en las cepas de Frankia estudiadas, los sideróforos tipo catecol (2) y los sideróforos tipo hidroxamato (18). La francobactina y la francobactina A son ejemplos de sideróforos tipo hidroxamato descritos en Frankia sp cepas 52065 y CeSI5 (18).

Resistencia a antibióticos.La búsqueda de marcadores genéticos en Frankia a través de los patrones de resistencia y sensibilidad a antibióticos ha puesto en evidencia la existencia de mecanismos de resistencia a los mismos en diferentes cepas. Se sabe que hay cepas resistentes a rifampicina, estreptomicina, kanamicina, tetraciclina, kasugamicina, lincomicina, gentamicina y novobiocina. Sin embargo, estos microorganismos muestran sensibilidad a ampicilina, penicilina G, neomicina, espectinomicina, thiostreptona, cloranfenicol y eritromicina (28). Es necesario mencionar que los patrones de resistencia-sensibilidad a antibióticos pueden variar dependiendo de las cepas probadas (en esto radica su valor como marcador genético para la diferenciación de cepas) como en el caso reportado por Carú (21) con frankias de la familia Ramnaceae.

Proteosoma. Entre las diferentes proteínas que libera Frankia al medio circundante destacan los complejos proteínicos multicatalíticos de alto peso molecular o proteosomas. Estas macromoléculas pueden ser útiles como abastecedores de aminoácidos cuando el microorganismo crece bajo condiciones saprofíticas. También podrían participar en la colonización de la planta actinorrízica promoviendo la despolimerización de proteínas de la pared celular del macrosimbionte. Esta megaproteína es similar desde el punto de vista estructural, bioquímico e inmunológico a los proteosomas característicos de las células eucariontes (8).

En la cepa de Frankia BR su proteosoma está involucrado en un fenómeno de autólisis. Se ha demostrado que la actividad de su megaproteinasa se ve incrementado cuando cesa el crecimiento en medio mineral con agitación magnética, reflejándose esto en un decremento de la biomasa de hasta un 50% (9).

Crecimiento. Como se mencionó previamente, la mayoría de las cepas de Frankia no son cultivables y su crecimiento es extremadamente lento, su tiempo de generación varía considerablemente en función de las condiciones de cultivo. Se ha logrado una apreciable disminución en el tiempo de crecimiento cuando se cultivan en agitación magnética a 200 rpm y agregando al medio fosfatidilcolina (78).

Para el aislamiento y cultivo de Frankia, se recomienda el uso de propionato de sodio como fuente de carbono, sin embargo, esta ácido orgánico de cadena corta puede ser utilizada por otras bacterias y no garantiza el éxito en el aislamiento de Frankia y sí el crecimiento de un contaminante. Los aislados nativos de Frankia nodulantes del árbol Casuarina en México se obtuvieron sólo cuando se usó el acetato de sodio en lugar de el propionato como fuente de carbono (96).Otro caso es el del aislamiento de Frankia de nódulos de Ramnáceas en que el propionato se substituyó por la glucosa (21).

Otro problema que se presenta para el aislamiento de este microorganismo es que generalmente se recomiendan medios de cultivo líquidos (recordemos que no forma micelio aéreo), los cuales no excluyen la posibilidad de obtener un co-cultivo, además de que existe la posibilidad de que en un mismo lóbulo se encuentren hospedadas más de una cepa de Frankia (10). Es por ello que se requiere obtener cultivos clonales a partir de esporas o de filamentos del microorganismo para estudios posteriores en donde es un prerrequisito contar con cultivos puros (95).

Fuentes de Carbono. Las fuentes de carbono utilizadas por Frankia para su crecimiento y desarrollo generalmente son diversas. Estas incluyen los ácidos grasos de cadena corta tales como el propionato y el acetato, ácidos grasos derivados del tween, intermediarios del ciclo del ácido cítrico tales como el succinato y el malato y algunos ácidos orgánicos como el piruvato (60, 1).

Existen algunas cepas que se propagan con la utilización de glucosa como fuente de carbono, tal es el caso de algunas frankias aisladas de los arbustos Colletia hystrix, Retanilla ephedra y Telguenea quinquinervis, pertenecientes a la familia Ramnaceae (21).

El hecho de que muchas cepas de Frankia no puedan utilizar los carbohidratos se le atribuye a la falta de sistemas transportadores de azúcares. La eficiencia en la utilización de carbohidratos de ciertas cepas de Frankia puede mejorarse a través del uso de tween, el cual incrementa la permeabilidad de la membrana celular.

En Frankia se ha demostrado la existencia del ciclo del ácido cítrico, ciclo del glioxilato y actividades enzimáticas de la gluconeogénesis. Las cepas que son capaces de utilizar la glucosa como única fuente de carbono, la catabolizan a través de la ruta de Embden-Meyerhof-Parnas. El propionato es metabolizado por una conversión a succinato a través de la vía de la propionil CoA carboxilasa (60).

Fuentes de Nitrogeno. Frankia puede utilizar el nitrógeno atmosférico, el amonio y los nitratos, así como varios aminoácidos como fuente de nitrógeno para su crecimiento in vitro. La asimilación del amonio producto de la fijación del nitrógeno atmosférico se lleva a cabo por el sistema glutamino sintetasa-glutamato sintasa (1).

Como mencionamos previamente, la fijación de nitrógeno atmosférico o reducción del mismo para el crecimiento de Frankia se lleva a cabo en el interior de las vesículas. Estas estructuras producto de la diferenciación celular en este actinomiceto, presenta una envoltura constituída fundamentalmente de dos tipos de lípidos hopanoides, el bacteriohopanotetrol (tetrol) y su monoester con el ácido fenilacético (ácido feniltetrol) (14), además de escualeno (29). El bacteriohopanotetrol se encuentra abundantemente en las células de Frankia, sin embargo, el ácido feniltetrol se encuentra en altas concentraciones sólo en las vesículas. Los hopanoides son triterpenoides tetracíclicos que tienen propiedades semejantes a los esteroles en cuanto a que modifican la permeabilidad de la membrana de muchos procariontes.

Cuando Frankia se encuentra viviendo en forma saprofítica o en simbiosis con las plantas actinorrícicas, la envoltura de sus vesículas constituye una barrera física que limita la difusión del oxígeno hacia la nitrogenasa, misma que si entra en contacto con ese gas se inactiva permanentemente. Si la tensión de O₂ aumenta, el grosor de la pared envolvente también aumenta. Esto se observa tanto en los cultivos bacterianos como en los nódulos (83, 45). Esta variación en el grosor de la pared sugiere un nivel específico de regulación del oxígeno en la vesícula que es dependiente del mismo oxígeno (13 ).

En los arbustos Coriaria y Datisca se ha visto que las vesículas de Frankia se encuentran rodeadas de mitocondrias de la célula hospedero, tal parece que la respiración mitocondrial juega un papel muy importante en la regulación de los niveles de oxígeno en el área donde se fija activamente el nitrógeno atmosférico en el nódulo (15).

Al igual que en la fijación de nitrógeno por Rhizobium, se ha demostrado que Frankia nodulante de Casuarina, presenta una hidrogenasa, tanto en cultivo como en simbiosis. Esta hidrogenasa recicla el hidrógeno que produce la nitrogenasa al reducir los protones, incrementando la eficiencia de la nitrogenasa. Dicha enzima, en Frankia requiere de niquel para su buen funcionamiento (81); cuando se agrega níquel al medio de cultivo, se incrementa la toma de H₂, pero no su desprendimiento. Se desconoce si el níquel juega algún papel en este tipo de hidrogenasas en Rhizobium.

En simbiosis, la planta hospedero afecta el metabolismo del hidrógeno en el endosimbionte (80). Se ha observado que una misma cepa de Frankia que se asocia con diferentes especies del árbol casuarina muestra diferencias en la fijación de nitrógeno y el metabolismo del hidrógeno dependiendo ambos procesos de la combinación Frankia-especie de planta.

Conclusiones

En los países tropicales de montaña existe un gran recurso natural al que podemos recurrir para enfrentar un buen número de problemas del ambiente. Nos referimos a las plantas actinorrízicas. Algunas pueden ser usadas en restauración ecológica urbana y rural, otras en producción de madera y de leña, etc.

Se desconocen muchos aspectos de la simbiosis que estas plantas llevan a cabo con diferentes microorganismos, consideramos de suma importancia la que lleva a cabo con su asociado fijador de nitrógeno, Frankia, pues un conocimiento apropiado de esta interacción podría conducir a un estado óptimo de eficiencia en su crecimiento y producción.

No menos importante es la falta de información sobre la bacteria misma. Esta carencia la ha propiciado su lento crecimiento, que no ha permitido desarrollar vectores genéticos ni mutantes que permitan conocer cómo funcionan sus genes. Tampoco hemos sido capaces de desarrollar métodos de cultivo que permitan aislar todo tipo de Frankia.

No obstante los científicos seguimos aceptando el reto de trabajar con este difícil y quisquilloso microorganismo y deseamos que se unan a nosotros muchos otros colegas.

Los autores de este capítulo queremos agradecer a la Dra. Esperanza Martínez Romero y al Sr. Julio Martínez Romero por la invitación a MV para compartir nuestra experiencia a través de estas páginas. El estudio de Frankia se ha hecho con el apoyo de CONACYT y de la Coordinación General de Posgrado e Investigación del Instituto Politécnico Nacional (proyecto 970432). También queremos agradecer al Biol. Martín Cuellar Cruz por la elaboración de los esquemas.

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