Ma del Rosario Morales Espinosa, Gonzalo Castillo Rojas, Yolanda López Vidal1, Alejandro Cravioto2.

1Lab. de Inmunología Molecular Microbiana. Facultad de Medicina, UNAM; 2Dirección, Facultad de Medicina, UNAM

Etiología

El patólogo Robin Warren a principios de junio de 1979, observó por primera vez a Helicobacter pylori en una biopsia gástrica proveniente de un paciente con gastritis crónica activa. Sus observaciones en estudios histopatológicas, continuaron por un par de años, asociando la presencia del microorganismo con esta patología. Durante este tiempo, hubó muchos intentos de aislar a la bacteria pero sin ningun éxito. En 1981, un médico gastroenterólogo, (Barry Marshall) se une a la investigación realizada por Warren y confirma lo reportado por éste último. La bacteria morfológicamente semejaba a un Campylobacter spp. razón por la cuál fué llamada Campylobacter pyloridis, y por tanto se emplearon los medios específicos de Campylobacter y las condiciones de su crecimiento para aislar a la bacteria de biopsias gástricas bajo las condiciones de crecimiento para Campylobacter spp. Sin embargo fue hasta 1982, que H. pylori fue aislado por primera vez y como suceso anecdótico, esto sucedió después de dejar el cultivo por más de 5 días gracias a que hubo un día de asueto, Easter weekend) que prolongo el fin de semana (94), dando el tiempo necesario para permitir el crecimiento bacteriano adecuado. Finalmente fue en 1984, que se publicó en la revista Lancet la asociación de H. pylori con la gastritis crónica y por primera vez se sugirío que la úlcera péptica puediera ser de etiología infecciosa. En 1994 se efectuó una conferencia consensus por los Institutos Nacionales de Salud, donde H. pylori es declarado la principal causa de úlcera péptica y es en éste mismo año que la Agencia Internacional para la Investigación del Cancer de la Organización Mundial de la Salud, declará que H. pylori es un cancerígeno en humanos.

Esta bacteria coloniza el estómago del hombre y como característica especial es la colonización en forma de parches en la mucosa gástrica, permaneciendo en la mucosa por años o décadas. Las personas infectadas con este organismo tienen una inflamación crónica superficial difusa que involucra tanto al antro como al fondo gástrico; la asociación de H. pylori con diferentes patologías gástricas es altamente significativa (5, 12, 13, 18, 21, 41, 65, 80).

H. pylori es un microorganismo gram-negativo, curvo, espirilado, que mide aproximadamente 3.5 por 0.5 micrómetros (Fig. 1), posee múltiples flagelos en uno de sus polos (de 5 a 6) lo que lo hace altamente móvil (12, 40). Es un microorganismo de crecimiento lento. Toma de 5 a 7 días para poder apreciar las colonias en medios solidos, y para su crecimiento en el laboratorio se requiere de condiciones de microaerofília (10% de CO₂) y medios artificiales ricos en nutrimentos como: peptona, triptona, extracto de levadura, glucosa, y sales como cloruro de sodio y bisulfito de sodio (12, 44), suplementados con sangre de caballo, polienriquecimiento, suero fetal bovino (SFB) o ambos. Su característica bioquímica más sobresaliente es la abundante producción de la enzima ureasa, que cataliza la hidrólisis de la urea en amonio y bióxido de carbono; la producción de amonio es un mecanismo importante para la sobrevivencia de la bacteria en un ambiente con pH tan ácido debido al jugo gástrico (31, 73).

En la actualidad se conocen otras especies de Helicobacter asociados con la mucosa gástrica y mucosa intestinal de diferentes hospederos como H. acinonyx asilado de mucosa gástrica de chitas, H. mustelae de hurones, H. nemestrinae de monos macaco y H. suis de cerdos, sin embargo, la única especie involucrada con el humano y enfermedad es H. pylori.

Epidemiología

Los estudios epidemiológicos han mostrado que la infección por H. pylori ocurre en la población mundial (16). Sin embargo, la incidencia de la infección entre países desarrollados y en vías de desarrollo es significativamente diferente (Fig. 2). Por ejemplo, en los Estados Unidos la incidencia anual de infección se presenta entre el 0.5% y el 1% para menores de 10 años y la infección aumenta hasta en un 50% en adultos, con un promedio de edad de 60 años (24, 34, 73). Por otro lado, en el grupo de afro-americanos, hispanos e indios nativos de ese país, la infección por el microorganismo se observa desde edades tempranas y la transmisión intrafamiliar es alta.

Por el contrario, se estima que en los países en desarrollo la mayoría de las personas (el 80% aproximadamente) se infectan con H. pylori a una edad promedio de 10 años; fenómeno que al parecer está relacionado con los factores anteriormente señalados (16,86). Además de la edad, el factor de riesgo más impotante es el de las carencias socio económicas. Se han investigado muchos factores, pero todos tienen como denominador común el bajo nivel económico. El hacinamiento, la vivienda insalubre y el agua contaminada, la promiscuidad y la consanguinidad están involucradas. El residir en comunidades cerradas -tales como hogares para pacientes con retardo mental, hospitales de estancia prolongada para enfermos crónicos y orfanatos- es otro factor de incidencia; en estas circunstancias, el contacto entre individuos es más cercano que el normal y las normas de higiene pueden ser menores. De hecho, se ha insistido en que la infección por H. pylori es un mejor indicador de las carencias mismas (16).

En países de Latinoamérica como Costa Rica y Brasil se reporta una incidencia anual de 45 enfermos de cáncer gástrico asociado a H. pylori por cada 100 000 habitantes. En algunos países como en México se han observado regiones de mayor riesgo, como las zonas altas del estado de Chiapas donde existen grupos indígenas que presentan una alta incidencia de cáncer gástrico asociado al microorganismo (41). En un estudio seroepidemiológico realizado en 1997, se trabajó con un banco de sueros representativo de la población de todos los estados de la República Mexicana (11,605 sueros) procedentes de personas cuya edad fluctuó entre 1 a 90 años (86). Los resultados mostraron que el 20% de los niños de 1 año de edad presentaban anticuerpos contra H. pylori y que la seropositividad aumentó hasta un 50% en los niños de 10 años de edad, lo que indicaba que la infección por el microorganismo en nuestro país se adquiere a edades tempranas y alcanza un 80% en los adultos jóvenes entre los 18 y 20 años de edad (86). La tasa de incremento de seropositividad fue aproximadamente del 5% anual durante los primeros 10 años de la vida.

En la actualidad no se conoce un reservorio no humano, lo que hace suponer que la infección es específica para el hombre, aunque se ha documentado la infección experimental por H. pylori en primates (16, 30), los cuales desarrollan un cuadro clínico de gastritis y úlcera muy parecido al del humano. Los mecanismos específicos de transmisión de la bacteria siguen sin determinarse, pero por el hecho de ser tan común de la infección y su amplia distribución, se postula que ocurre de persona-persona, por las vías oral-oral y oral-fecal (16). La familia del enfermo en la transmisión vertical es probablemente un factor de riesgo importante para perpetuar la infección. Dentro de las consideraciones epidemiológicas se debería de considerar el diagnóstico y tratamiento de los miembros de la familia ya que frecuentemente el tratamiento es personal y se omite investigar si hay otros miembros de la familia que presenten síntomas similares. Esta omisión repercute en la eficacia del tratamiento y hace difícil de valorar si la infección en un individuo que ha recibido tratamiento se debe a la reinfección por el tipo de cepa que predomina en el grupo familiar (donde puede transmitirse la infección) ó por una cepa externa, o bien, 2) si se trata de recrudescencia de la enfermedad por cepas resistentes al tratamiento antimicrobiano elegido.

H. pylori es el agente etiológico en un 70% a un 80% de la forma más común de inflamación gástrica crónica denominada gastritis atrófica crónica tipo B (7, 12, 13, 21, 35, 36, 41, 65, 66). La enfermedad involucra el antro y el fondo del estómago, con una imagen histológica que incluye con frecuencia infiltrado de linfocitos, células plasmáticas y algunos eosinófilos; este proceso inflamatorio al parecer es más importante en el antro que en el cuerpo (4, 7, 54, 64). H. pylori coloniza la mucosa gástrica permaneciendo por años e incluso por décadas en la mayoría de los casos (7,12), con mínima sintomatología para el paciente. Sin embargo en algunos casos se han descrito cambios morfológicos importantes en mucosa gástrica que van desde un proceso inflamatorio leve, hasta el desarrollo de una gastritis que evoluciona a una úlcera, con lesiones atróficas que pueden terminar en metaplasia, displasia y finalmente en un adenocarcinoma (7, 8, 11, 18, 21, 35, 36, 41, 49, 59, 70, 83).

La distribución de H. pylori en el estómago es al parecer muy importante, pues prodría determinar el resultado patológico de la gastritis. Los sujetos con gastritis predominantemente antral tienden a presentar una secreción normal o elevada de ácido gástrico y al parecer se incrementa el riesgo de desarrollar una úlcera duodenal. Los pacientes en los que se coloniza predominantemente el cuerpo del estómago tienden a desarrollar inflamación que puede derivar en gastritis atrófica (Fig. 3), que a su vez tiende a desarrollar úlcera gástrica (Fig. 4) o cáncer.

H. pylori puede colonizar únicamente el epitelio de tipo gástrico y no se encuentra en el duodeno normal. Es un microorganismo excelentemente adaptado a su nicho ecológico, descansando en la superficie de las células epiteliales gástricas bajo la capa de moco adherente. La forma espiral y la motilidad conferida por sus múltiples flagelos le ayudan a distribuirse a través de la capa de moco para alcanzar la mucosa gástrica (Fig. 5). La metaplasia gástrica (el reemplazo de las células columnares que normalmente cubren el vello duodenal por epitelio de tipo gástrico rico en mucina neutral) se presenta en más del 90% de los pacientes con úlcera duodenal y permite al H. pylori colonizar el bulbo duodenal. La colonización de la mucosa duodenal produce inflamción (duodeitis crónica), que vuelve a la mucosa duodenal vulnerable al ataque por ácido, pepsina o bilis, con la ulceración subsiguiente. El grado de metaplasia gástrica en duodeno esta directamente relacionado con el nivel de secreción de ácido gástrico.

Fisiopatología

Gastrina y somatostatina

La infección por H. pylori produce anomalias importantes en la secreción de hormonas de polipéptidos gastrointestinales por el antro gástrico. Estas anomalias tienen consecuencias importantes en la fisiopatología gástrica y en las causas de la ulceración.

La gastrina es una hormona péptidica producida por las células G, que se encuentra principalmente en el antro del estómago. Las dos formas biológicamente más activas de gastrina son la G₁₇ y la G₃₄, siendo sus pesos moleculares la diferencia entre ellas. La gastrina estimula la secreción de ácido gástrico y también actúa como una hormona trópica ante las células pariétales secretoras de ácido en el cuerpo gástrico. Una prolongada hipergastrinemia (hipersecresión de ácido gástrico por la sobreproducción de gastrina) subsiguiente a una infección por H. pylori puede dar por resultado un incremento en el número y masa de células pariétales. Desde hace tiempo se conoce que esta condición está presente en los pacientes de úlcera duodenal, pero su origen apenas ha empezado a comprenderse con el descubrimiento de los efectos que produce H pylori en la fisiología gástrica.

La síntesis y liberación de gastrina de las células G está bajo el control inhibitorio de la somatostatina, que es producida por las células D del antro. La infección por H. pylori está asociado con un incremento en las concentraciones de gastrina sérica. Comparado con sujetos voluntarios sanos H. pylori negativos, los sujetos con presencia positiva de H. pylori tienen incrementadas las concentraciones basales (entiendase como concentraciones basales a las normales y en forma constante en condiciones fisiológicas, sin aumento normal por el estimulo de los alimentos) de gastrina estimuladas por el PLG y por los alimentos, en el torrente sanguíneo. Este incremento en gastrina circulante se debe sobre todo a un incremento en la G₁₇, que se origina principalmente en la mucosa en el antro, en donde predomina la infección por H. pylori. La erradicación de la infección produce una remisión completa de la hipergastrinemia. El ver, oler y probar los alimentos es estimulo suficiente para la secreción de ácido por el estómago y la fase inicial de esta secreción de ácido es mediadad a través del nervio vago. Sin embargo el principal estimulo para la secrecíon de ácido gástrico ocurre cuando la comida entra al estómago. Los componentes proteícos de los alimentos estimulan a las células G productoras de gastrina para la liberación de la hormona gastrina. Esta hormona pasa a la circulación sistémica y estimula las células pariétales en el cuerpo del estómago para secretar ácido. Cuando aumenta el ácido en el antro del estómago, éste ejerce un control inhibitorio negativo para prevenir mayor secreción de ácido el cuál puede dañar a el estómago y a el duodeno. Además como el pH en el antro baja, éste descenso en el pH estimula la liberación de somatostatina de las células D, las cuales están en estrecha relación con las células G. Además cuando las proteínas y la grasa contenida en los alimentos junto con el ácido gástrico entran al duodeno estimulan la liberación de colecistoquinina, la cuál inhibe la liberación de gastrina por estimulación de la somatostatina. La somatostatina es la clave para el control inhibitorio y ahora es claro que la infección por H. pylori interrumpe este importante mecanismo control.

Secreción de ácido y pepsina

La producción pico de ácido basal, estimulada por el PLG y el pentagastrín, es significativamente más elevada en pacientes H. pylori positivos con úlcera dodenal que en los sujetos de control sanos, H. pylori negativos. La producción basal de ácido en pacientes con H. pylori y úlcera duodenal disminuye significativamente tras la erradicación de H. pylori. La producción de ácido estimulada por el PLG se incrementa seis veces en los pacientes infectados por H. pylori con úlcera duodenal, pero cae 66% al mes y vuelve a lo normal al año de la erradicación de H. pylori. Estos cambios en la secreción de ácido se acompañan con cambios similares en la producción de pepsina. Estas observaciones respaldan la hipótesis de que la infección por H. pylori daña el control inhibitorio de la secreción de ácido gástrico, que es mediada en gran parte por la somatostatina. El incremento en la secreción de ácido gástrico puede dar como resultado un incremento en la carga de ácido duodenal y la aparición de una duodenitis subsiguiente a la colonización por ulceración debida a H. pylori.

Diagnóstico

Al igual que en cualquier otra condición, el diagnóstico es esencial antes de iniciar el tratamiento. Hay varias técnicas de diagnóstico disponibles. Los métodos empleados para el diagnóstico involucran pruebas invasivas y no invasivas, cualquiera de estas pruebas son de alta especificidad y sensibilidad.

Los métodos invasivos son pruebas realizadas en el hospital que emplean biopsias gástricas tomadas en endoscopía para realizar; pruebas histológicas, de cultivo bacteriano y la prueba rápida de ureasa (CLO).

Histología

Las pruebas endoscópicas gástricas de antro o de cuerpo se fijan en formalina, se procesan rutinariamente y se tiñen, sea con hematoxilina y eosina, Warthin-Starry o tinción modificada de Giemsa. Estos métodos han mostrado ser sensibles (90%) y específicos (90%) para la identificación de H. pylori, pero se requiere de un histopatólogo experimentado. Para el endoscopista es un procedimiento de rutina obtener biopsias de la mucosa durante el proceso. La histología proporciona información relacionada con la severidad de la gastritis (grado de infiltración de células polimorfonucleares y degeneración celular) y la posible presencia de alteraciones premalignas, tales como la metaplasia intestinal o displasia de la mucosa gástrica.

Cultivo bacteriano

Las biopsias gástricas se colocan en un medio de transporte de Stuart, en un caldo Brucela o solución salina isotónica estéril. Dentro de las horas siguientes se inoculan en medios selectivos suplementados con sangre de caballo o polienriquecimiento (medio que tiene factores y cofactores para el desarrollo de microorganismos fastidiosos) y antibióticos. Las placas se incuban con 5% de O₂, 10% de CO₂ y 85% de N (condicones de microaerofilia) (Fig. 6), a 37oC durante 5 a 7 días. La identificación del microorganismo se hace a través de su morfología colonial (Fig. 7), tinción de Gram y características bioquímicas (catalasa, oxidasa y ureasa positivas). La especificidad y sensibilidad de esta prueba es del 90% y 95% respectivamente. H. pylori es una bacteria difícil de cultivar y este método es prolongado y costoso. Incluso en laboratorios competentes hay una considerable incidencia de fallas en la recuperación del microorganismo. Sin embargo este método es indispensable para determinar la susceptibilidad antimicrobiana de la bacteria, y para la extracción de ADN para el uso de técnicas moleculares.

Prueba rápida de ureasa

Esta prueba depende de la potente enzima ureasa producida por H. pylori, que hidroliza la urea en amonio y CO₂. Se coloca una biopsia gástrica en el centro de la prueba CLOtest (disponible comercialmente). Un resultado positivo se indica por un cambio en el color indicador de pH, de amarillo a rosa mexicano, en el término de minutos a 1 hora como máximo. Pueden presentarse resultados positivos falsos por la presencia de otros microorganismos productores de ureasa (estreptococos, Proteus spp.). Pruebas caseras se pueden usar fácilmente en el laboratorio (Fig. 8). Esta prueba da un resultado instantáneo, que puede comunicarse el médico mientras se prepara el informe de la endoscopía.

Todos estos métodos basados en biopsias pueden proporcionar resultados falsos negativos si se toman biopsias sólo de antro durante la semana siguiente de haber tomado inhibidores de bomba de protones, antibióticos o sales de bismuto. En estos casos deberá tomarse también biopsias de cuerpo del estómago.

Las pruebas diagnósticas no invasivas para H. pylori son metódos disponibles en la primera atención y estas comprenden; la detección de anticuerpos contra H. pylori en el suero del paciente y la prueba de urea en el aliento.

Detección de anticuerpos contra H. pylori

La detección de anticuerpos IgG contra H. pylori, en una muestra de suero es realizada por el método de ELISA, es especialmente útil para detectar la infección por esta bacteria en los pacientes. Pueden presentarse resultados falsos negativos sobre todo en niños, ancianos y sujetos inmunocomprometidos que no han desarrollado una respuesta inmunológica adecuada a la infección. La serología juega un papel limitado en la confirmación de la erradicación de H. pylori, ya que en la mayoría de los pacientes, lleva de 6 a 12 meses para que el título de inmunoglobulina G descienda al 50% (porcentaje tomado generalmente como indicador de erradicación) o menos del valor de pretratamiento. Todas las pruebas serológicas (sobre todo si son comerciales) deberan de evaluarse en forma independiente en la población a estudiar, mediante pruebas contra un panel de sueros de pacientes H. pylori negativos (control) de la misma población para establecer el valor de corte, ya que los valores de corte proporcionados por el fabricante con frecuencia no son válidos. La prueba con saliva para H. pylori no es tan sensible ni tan específica como las basadas en suero y la prueba con jugo gástrico esta en espera de validación adicional.

Prueba de urea en el aliento

Estas prueban utilizan isótopos C¹³ (no radioactivo) y C ¹⁴ (radioactivo), son fáciles de realizar, seguras, de alta sensibilidad (95%) y especificidad (100%). La prueba de aliento en urea implica la recolección de una muestra de aliento antes y otra 30 minutos después de beber una solución con isótopos C¹³ o C¹⁴. Si H. pylori está presente, su enzima ureasa hidrolizará la urea en CO₂ ¹³ o ¹⁴ que finalmente será excretada en el aliento. Pueden presentarse resultados falsos negativos si la prueba se hace dentro de la semana siguiente de haber tomado inhibidores de la bomba de protones, antibióticos y sales de bismuto, o después de una cirugía gástrica. Hasta ahora, la prueba de urea con C¹³ está disponible para pacientes seleccionados, pero pronto saldrá al mercado. La prueba de urea en el aliento es la opción para confirmar la erradicación de H. pylori y ésta debe hacerse como mínimo un mes después de terminado el tratamiento. La prueba no radioactiva con C¹³ no presenta contraindicaciones para su uso, ni límites al número de pruebas que pueden aplicarse a cualquier individuo.

Genoma bacteriano

En la actualidad se ha realizado la secuenciación del genoma completo de dos cepas de H. pylori: la cepa 26695 que fue aislada en el Reino Unido en 1987 de un paciente con gastritis y la cepa J99 aislada en Estados Unidos en 1994 de un paciente con úlcera duodenal. El cromosoma circular de la cepa 26695 contiene 1,667,867 pb (Fig. 9) y el de la J99 1,643,831 pb. Estos tamaños son similares al de Haemophilus influenzae y a aproximadamente a una tercera parte del de E. coli. El promedio en el contenido de G + C es del 39% en ambas cepas secuenciadas. Sin embargo 5 regiones en el genoma de la cepa 26695 y 9 en la J99 se han encontrado con diferente composición de G + C. La región 2 (con 35% de G + C) de la cepa 26695 corresponde a la isla de patogenicidad cag asociada con la producción del antígeno CagA y la sobreregulación de interleucina (8). Las otras 4 regiones no han sido bien caracterizadas experimentalmente. Sin embargo, la región 1 y 3 (con 33% de G + C) contienen copias de la secuencia de inserción IS605, de los genes 5S RNAr y una secuencia repetida de 521 pb. Además, la región 1, contiene el gen virB4, el cuál codifica la proteína involucrada en la transferencia del ADN-T en Agrobacterium tumefaciens y en la secreción de la toxina de Bordetella pertusis. La región 4 (con 43% de G+C) contiene fusionados los genes rpoB y rpoC que codifican para las subunidades b y b' de la ARN polimerasa. El gen fusA, el cuál codifica para el factor de elongación de la traducción EF-G está también asociado con esta región. Finalmente la región 5 (con 33% de G+C) contiene dos sistemas de modificación/ restricción.

Ambos genomas contienen dos copias de los genes 16 S y dos juegos de los genes 5S-23S del ARN ribosomal, además la cepa 26695 contiene un gen extra del 5S ARNr. En contraste a otras bacterias los genes ARNr de H. pylori no estan situados continuamente en el cromosoma, sugiriendo que su regulación es más compleja que la de otros procariontes. Ambos genomas codifican para 36 especies de ARNs de transferencia, aparentemente localizados en las mismas regiones del mapa cromosomal en las dos cepas. Ninguna de las dos cepas contiene ARN de transferencia para asparagina y glutamina, sin embargo se han identificado genes homólogos a gatABC de Bacillus subtilis los cuales en H. pylori son los responsables de la amidalación de glutamato a glutamina por la acción de la glutamil-RNAt sintetasa y de aspartato a asparagina. Otras características que comparten ambas cepas, incluyendo la ausencia de un origen de replicación identificable, una longitud promedio de secuencias codificables, de donde se han detectado 1590 marcos de lectura abierta para la cepa 26695 y 1495 para la J99 representando el 90.8 y el 91% del genoma respectivamente.

Tipificación molecular de H. pylori

El diagnóstico molecular y la tipificación de H. pylori pueden darnos información invaluable para estudios epidemiológicos y clínicos, así como para determinar la estructura genética de las poblaciones y entender la evolución del microorganismo. Técnicas sensibles y eficientes que nos permitan diferenciar los aislamientos clínicos son necesarias, para tales objetivos se han desarrollado técnicas moleculares basadas en el alto grado de variabilidad genómica entre las cepas de H. pylori.

Ribotipificación

El principio de este método esta basado en la digestión del DNA cromosomal de diferentes cepas de H. pylori por endonucleasas de restricción seleccionadas tales como: HindIII, HaeIII y DraI. Subsecuentemente, tales patrones de digestión de los genes ARNr son visualizados por hibridación con sondas especificas de ADN o ARN marcadas radioactiva o no radioactivamente. Este método ha sido aplicado exitosamente para tipificar aislamientos de H. pylori.

Polimorfismo en la longitud de fragmentos de restricción (RFLP)

El ADN cromosomal intacto es digerido por endonucleasas de restricción y separado por corrimiento en electroforesis en gel por campos pulsados (PFGE). Los mapas genéticos pueden ser construidos por hibridación con los fragmentos de restricción con sondas de ADN preparadas de genes conocidos.

PCR-RFLP

Los fragmentos de ADN son primero amplificados usando PCR con iniciadores generados a partir de genes conocidos, seguido por digestiones con enzimas de restricción. Las cepas de H. pylori se pueden diferenciar con esta técnica utilizando los genes de las ureasas incluyendo a ureA, ureB, ureC y ureD.

AP-PCR o RAPD

Esta técnica involucra amplificaciones al azar de fragmentos de ADN con iniciadores de secuencias de nucleótidos diseñados arbitrariamente. Los perfiles de fragmentos de ADN amplificados azarosamente pueden discriminarse entre las cepas probadas.

Tipificación por secuenciación de DNA

Este método esta basado en la amplificación por PCR de genes conocidos, que son polimórficos y comunes para todas las cepas de H. pylori. Subsecuentemente, las secuencias de nucleótidos de los fragmentos amplificados de diferentes aislamientos son determinadas y comparadas por la secuenciación directa del ADN.

Tipificación por PCR de alelos específicos

Este método ha sido recientemente desarrollado para detectar cepas "ulcerogénicas" basado en regiones representativas de los genes vacA y cagA de las cepas de H. pylori. Se utilizan iniciadores específicos que son generados de regiones individuale para caracterizar de alelos específicos del gen a estudiar (por ejemplo para vacA el tipo de alelo de secuencia señal s1a, s1by s2 y región media m1 y m2).

Patogénesis

A pesar de la alta incidencia de la infección por H. pylori a nivel mundial, no todas las personas infectadas por esta bacteria desarrollan una enfermedad, al parecer el tipo de cepa bacteriana que se encuentra colonizando la mucosa gástrica tiene una función determinante en el desarrollo de la enfermedad (4, 7, 8, 9, 17, 36, 43, 77, 84, 95, 98). Se han propuesto varios mecanismos de virulencia para H. pylori, uno de ellos es la producción de ureasa (28, 31, 38, 47, 56, 74). Esta enzima se caracteriza por tener un peso molecular de 550 kDa y está formada por dos subunidades UreA y UreB; es una de las proteínas más abundantes, ya que constituye el 5% del total de proteínas que origina del microorganismo. La ureasa hidroliza la urea y necesita que dos iones de nickel (Ni2⁺) se fijen en su sitio activo redituando amonio y bióxido de carbono. El amonio es un agente neutralizante del ácido hidroclorhídrico del estómago, que ocasiona transitoriamente aclorhídria con un pH gástrico neutro. Este proceso permite que H. pylori se mueva rápidamente y atraviese la capa de moco para llegar al epitelio gástrico (4, 54, 56). Estudios con cerdos gnotobióntes (32, 56) indican que cepas mutantes de H. pylori que son incapaces de producir ureasa, pierden la habilidad de colonizar el estómago, lo que sugiere que la producción de ureasa participa en la colonización de la mucosa gástrica y en la sobrevivencia del microorganismo en el pH ácido del estómago. Más aún, la ureasa per se y el amonio como producto final del desdoblamiento, tienen una función importante en la inflamación induciendo la respuesta inmune, ya que el amonio actúa como factor quiomiotáctico que activa a los monócitos y leucocitos polimorfonucleares para liberar citocinas y ocasiona una respuesta inflamatoria localizada con daño del tejido del epitelio gástrico (4, 9, 54, 56).

Otro factor de virulencia es el lipopolisacárido (LPS) que posee en su antigeno "O" los carbohidratos de Lewis "x" (Lex) o Lewis "y" (Ley) o ambos (1, 3, 9, 49, 54, 64). En un trabajo reciente se demostró que la estructura del LPS de la cepa NCTC 11637 es similar al antigeno Lewis "x", presente en el grupo sanguíneo tipo O ² y en la superficie de las células epiteliales gástricas (1, 2, 3, 49). La cepa MO19 tiene un LPS tipo Lewis "y" 1 y la cepa P 466, expresa tanto Lewis "x" y Lewis "y" 1. Los niveles de expresión de estos antígenos (Le) son diferentes entre cepas y muestran variación de fase (Fig. 10) estimulada por un pH ácido en el medio y el tipo de antígeno de Lewis que se exprese en la superficie de las células epiteliales (1, 3, 9, 49, 56, 71) y en la superficie de las células sanguíneas. Los genes involcrados en esta variación de fase son dos glucosiltransferasa y un fucosiltransferasa . Los antígenos Lewis son glucoconjugados con diferente número de residuos de fucosa y pueden ser de 4 tipos: Le^a, Le^b, Le^x y Le^y. Los antígenos Lewis tienen una participación dual en la patogénesis, por un lado, producen un mimetismo molecular, que posiblemente ayuda al microorganismo a evadir la respuesta inmune en el momento de la colonización en el estómago y con ello favorece su permanencia por tiempo prolongado en el nicho gástrico (9, 54, 56, 64, 71) y por el otro provocan una respuesta autoinmune contra los antígenos Lewis que expresa H. pylori y que son compartidos por las células eucariontes contribuyendo al daño directo o indirecto (4, 9, 54, 64, 71).

Aproximadamente el 60% de las cepas de H. pylori producen proteínas codificadas por genes localizados en una isla de patogenicidad denominada cag (PAI-cag) (9, 17, 20, 38, 39, 43, 47, 56). Esta isla tiene un tamaño aproximado de 40 kb, con alrededor de 40 genes. PAI-cag presenta características similares a las de otras islas de patogenicidad encontradas en E. coli, Salmonella y Yersinia. Las características de la isla de patogenicidad de H. pylori (38, 43, 56) son las siguientes: (i) su contenido de G + C es de 35% comparado con 39% del cromosoma bacteriano; (ii) contiene genes putativos de virulencia y genes que codifican para proteínas del sistema de secreción tipo IV; (iii) presenta una o dos secuencias de inserción (IS605 y IS606) en algunas cepas; (iv) en otras cepas está flanqueada por secuencias repetidas directas, las cuales participan importantemente en la integración de la isla dentro del genoma bacteriano.

La PAI-cag puede estar organizada de forma diferente dependiendo de la cepa que se estudie (Fig. 11): La isla puede estar continua en una misma región o estar dividida en dos regiones cag I y cag II por una secuencia de inserción (IS605) o estar dividida en dos regiones cag I y cag II por secuencias del cromosoma bacteriano, flanqueado por una secuencia de inserción (IS605) y una o ambas regiones (cagI y/o cagII) de la isla presenten pérdidas parciales de nucleótidos. Estas variaciones en la estructura de PAI-cag pudieran explicar la existencia de cepas PAI-cag- y cepas PAI- cag⁺ (17, 20, 34, 38, 47, 56).

Sin embargo la variabilidad existente entre las cepas de H. pylori no sólo esta dada por la organización de PAI-cag, sino por otras regiones en el cromosoma de las cepas, como lo muestran los trabajos realizados por Kersulyte y col. (48) y por Van Doorn y col. (88) quienes caracterizaron por secuenciación una región de ADN localizada fuera de PAI-cag, hacia el extremo 3' de la isla de patogenicidad cag entre el gen cagA y el gen glr (glutamato racemasa), de 500 cepas de H. pylori procedentes de diferentes regiones del mundo. Estos autores demostraron gran diversidad entre la longitud del ADN de esta región (con un intervalo de bases de 0.5 a 3 kb), debido a inserciones, deleciones y sustituciones de pares de bases, clasificando a las cepas de H. pylori en 5 tipos diferentes, Los tres principales tipos detectados fueron: el tipo I que predominó en las cepas aisladas de pacientes de origen español, peruano, guatemalteco, africano y norteamericano; el tipo II con predominio entre las cepas aisladas de pacientes japoneses y chinos; el tipo III predominó entre las cepas de pacientes de la India (Calcuta). Las secuencias de nucleótidos del gen cagA de las cepas de H. pylori de los pacientes de Perú tuvieron una alta homología con las cepas de los pacientes de España, no así con las cepas de pacientes de Asia y del norte de Europa, sugiriendo que las cepas de H. pylori fueron diseminadas del continente Europeo hacia el continente Americano a partir de su descubrimiento.

Un factor de virulencia importante es una proteína de membrana externa denominada Proteína Asociada a la Citotoxina (19, 24, 87) (CagA), la cual es codificada por el gen cagA que se encuentra localizado en el extremo 3' de PAI-cag, esta proteína tiene un peso molecular que varia entre 120 y 140 kDa, es altamente inmunogénica y su función se desconoce. Sin embargo, la detección de anticuerpos contra CagA de H. pylori está bien documentada (23, 24, 34, 66). Cover y col. realizaron los primeros estudios donde detectaron niveles elevados de anticuerpos IgG por ELISA contra CagA en pacientes con úlcera duodenal en un 87.5%, con úlcera gástrica en un 76% y con dispepsia no ulcerosa en un 56.4%, con una diferencia estadísticamente significativa de p<0.001 para pacientes infectados con cepas CagA ⁺ y úlcera péptica (23, 34, 65, 66, 77, 83) por lo que ellos proponen la expresión del gen cagA como un marcador de virulencia (19, 23, 24, 55).

En pacientes infectados con cepas que tienen el gen cagA y expresan la proteína CagA, se aprecia una asociación con el desarrollo de gastritis activa crónica, gastritis atrófica, úlcera péptica y con un aumento en el riesgo de desarrollar adenocarcinoma o linfoma gástrico (11, 34, 53, 65, 66, 77, 80, 83, 91, 92, 95). Las infecciones con cepas que carecen de la expresión de esta proteína se han asociado con patologías menos graves. En contraste, estudios hechos en poblaciones de Japón, Corea y China han reportado que más del 90% de las cepas son cagA-positivas, independientemente del estado clínico de los pacientes (45, 53, 58, 66, 80, 83). De estos resultados se ha sugerido que no sólo es importante la presencia de cagA sino el tipo de cagA que posee la bacteria.

El análisis de nucleótidos del gen cagA, ha mostrado que la región 5' está altamente conservada, mientras que la región 3' del gen presenta un número variable de secuencias repetidas y que, al transcribirse, determina el tamaño de la proteína CagA (56, 97). El análisis del extremo 3' del gen cagA en 155 cepas cagA-positivas, con base en su secuencia y organización estructural, permitió identificar cuatro alelos de cagA designados como tipos A, B, C y D (Fig. 12) (56, 87, 97). Las cepas tipo C se han asociado con mayores niveles de anticuerpos anti-CagA en pacientes con gastritis atrófica severa o con cáncer gástrico.

La producción de una citotoxina vacuolizante (VacA) es, sin lugar a dudas, otro factor de virulencia importante de H. pylori. VacA (10, 15, 22, 26, 32, 35, 44, 51, 57, 68, 69, 75) es responsable de la formación in vivo de vacuolas en células del epitelio gástrico, así como en diferentes líneas celulares in vitro. La administración oral de la citotoxina a ratones lactantes es capaz de producir degeneración de la mucosa gástrica (75, 84).

La citotoxina vacuolizante está codificada por el gen vacA que es constitutivo y se encuentra en una sola copia en el cromosoma de H. pylori fuera de esta isla de patogenicidad. El gen vacA tiene aproximadamente 3864 pb, presenta 5 marcos de lectura abierta, sólo un marco de lectura es el adecuado para codificar la citotoxina vacuolizante (9, 27, 38, 56, 76, 78, 87).

Desde 1994 se realizaron los primeros estudios en los que se reporta la secuencia completa del gen vacA en la cepa de H. pylori (60190 tox+) y en la cepa 87-203 (tox-). El análisis de un fragmento del gen vacA de 1541 pb mostró una homología del 64.8% entre las secuencias de nucleótidos de la cepa tox+ y la cepa tox- (5, 27, 37, 56, 76). Se identificó además una región de 567 pb aproximadamente, localizada a la derecha del gen vacA, que correspondió al gen del ARNt de la cisteina-sintetasa (9, 27, 38, 56, 76, 78, 87), homólogo al de E. coli. En 1995 se analizó una región de 0.73 kb en 10 cepas tipo de H. pylori, la cual correspondió a la región media del gen vacA (5). Esta región media mostró una identidad nucleotídica del 70.4% entre las cepas tox+ y las cepas tox- y una identidad en aminoácidos del 58.7% (Fig. 13). Con base en sus secuencias las cepas se clasificaron en dos familias de alelos; alelo tipo m1 (para cepas con actividad citotóxica) y alelo tipo m2 ( para cepas sin actividad citotóxica). Se analizó también la secuencia de un fragmento de 0.5 kb, que correspondía a la región de la secuencia señal del gen vacA, con diferencias importantes entre las cepas tox+ y tox-. Con estos resultados se clasificó a las cepas en tres familias de alelos; alelo tipo s1a, tipo s1b y s2 (5).

En 1995 Atherton y col. (5) realizaron la caracterización del gen vacA de 59 cepas de H. pylori, aisladas de pacientes con diferentes patologías (úlcera péptica, gastritis y asintomáticos) en los Estados Unidos con iniciadores específicos y la reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Amplificaron la región de la secuencia señal (s1a, s1b, s2) y la región media (m1 y m2) de cada una de las cepas de los pacientes estudiados y reportaron que los pacientes presentaron cepas con los genotipos s1a/m1, s1a/m2, s1b/m1, s1b/m2 y s2/m2, no encontrando pacientes con cepas con el genotipo s2/m1. Al estudiar la actividad citotóxica en monocapas de células HeLa, de los sobrenadantes de cada una de las cepas aisladas de su población de estudio, observaron que las cepas presentaban diferente actividad citotóxica, clasificándola en alta, media, y nula (5, 44, 51). En este mismo estudio, los autores observaron también una asociación significativa entre el genotipo de vacA y la actividad vacuolizante, reportando que las cepas con genotipo s1a/m1 eran las que presentaban mayor actividad citotóxica; que las cepas con genotipo s1b/m1, s1a/m2 y s1b/m2 presentaban una actividad media; mientras las cepas con el genotipo s2/m2 no presentaban actividad citotóxica. Reportaron además que las cepas s1a/m1 se aislaban con mayor frecuencia en pacientes con úlcera péptica, que las cepas tipo s1b/m1 se encontraban fundamentalmente en muestras de pacientes con gastritis; mientras que las cepas s2/m2 se aislaban en mayor número de pacientes asintomáticos (5, 7, 8).

Atherton y col. señalaron que el tipo de secuencia señal del gen vacA es responsable del grado de inflamación (infiltración de neutrofilos y de linfocitos) en mucosa gástrica y la región media del gen es responsable del daño en tejido epitelial (degeneración epitelial, deplesión de moco y erosiones microscópicas en el tejido) y que son las cepas tipo s1a, las que se asocian a mayor infiltrado celular en comparación de las cepas tipo s1b y s2. Las cepas con región media tipo m1 se asocian con mayor daño a tejido que las cepas tipo m2 (4, 7, 8). Esta bien documentado que los genotipos de vacA son buenos predictores de enfermedad ulcerosa; en un estudio realizado en Estados Unidos se encontró que el 90% de los pacientes con úlcera duodenal tuvieron cepas tipo s1, donde los pacientes infectados con cepas tipo s1a de vacA presentaron mayor probabilidad de desarrollar úlcera péptica que pacientes con cepas tipo s1b y mucho menos probable cuando presentaron cepas s2, las que se aíslan en mayor frecuencia de pacientes asintomáticos. La distinción entre cepas tipo s1a y tipo s1b puede ser principalmente académica: ya que en términos prácticos todas las cepas tipo s1 son potencialmente ulcerogénicas.

A pesar de que este sistema de genotipificación de vacA ha sido exitoso para el estudio de H. pylori aislado de pacientes en los Estados Unidos y algunos países de Europa, la dicotomía m1/m2 no parece ser suficiente para clasificar cepas provenientes de países de Asia y, probablemente, de otras partes del mundo (6, 42, 45, 46, 66, 67, 88, 89). En Alemania se reporta un estudio 42 de 30 cepas de H. pylori aisladas de pacientes con gastritis crónica activa, úlcera péptica y cáncer gástrico en el que sólo tres de ellas no pudieron caracterizarse con los iniciadores específicos (5) en la región media del gen vacA. Al hacer el análisis de nucleótidos de la región media de estas tres cepas los autores encontraron una diferencia de nucleótidos de un 9.3% cuando se comparó con la secuencia de región media de una cepa tipo m1 (NCTC 11638) y hasta una diferencia de 29% cuando se comparó con una cepa tipo m2 (Tx30a). A esta nueva región media se le denominó tipo m3 (42, 77, 81). Al igual que en Alemania, estudios en Bélgica (89, 90) han mostrado una nueva región media para el gen vacA, designada como m1a y otra región media tipo m1-m2 en cepas aisladas de pacientes chinos (63, 64). En estos reportes de Japón, Tailandia, Hong Kong, Holanda, Italia, Francia, Australia y otros más (6, 42, 45, 46, 63, 64, 66, 67, 77, 81, 88, 89), donde la caracterización completa de la región secuencia señal o la región media del gen vacA no se realizó completamente, se tuvo la necesidad de secuenciar las cepas no caracterizadas y diseñar nuevos iniciadores para caracterizar su población de estudio.

Un estudio realizado en México 61 mostró que el 60% de los pacientes mexicanos presentaron infección múltiple con cepas de H. pylori con diferentes alelos de vacA, sugiriendo que la infección múltiple en la población estudiada es común. En este mismo estudio se reportó la distribución de los genotipos vacA, refiriendo que el genotipo secuencia señal s1b de H. pylori estuvo presente en el 80% de los pacientes estudiados, el genotipo s2 en el 45% de éstos y el genotipo s1a en el 10%, además se detectó en estos pacientes el genotipo s2/m1. Esta frecuencia de genotipos es comparable con la reportada en otros países de América Latina, como son: Costa Rica, Colombia y Perú (88) donde el genotipo predominante fue s1b con el 98.6%, mientras que ninguno de ellos reportó cepas con el genotipo s1a. Estudios realizados en Portugal y España (88, 89) han reportado resultados similares, cepas con el genotipo s1b que predomina con el 88.7%, con la diferencia que el genotipo s1a es de 11.3%.

La región de secuencia señal y la región media del gen vacA son muy diversas en los H. pylori de pacientes mexicanos como lo revela el análisis de secuencia de nucleótidos y la falta de caracterización de alelos de vacA, con los iniciadores descritos de cada región (5). El análisis de secuenciación de nucleótidos de la región secuencia señal de cepas mexicanas permitió agrupar a las cepas de H. pylori en un nuevo subtipo de familia de secuencia señal la que se designó s1d (62). Las secuencias de la región media del gen vacA de la mayoría de las cepas presentaron una alta homología con las cepas tipo m1. Sin embargo una cepa tipo m2 presentó una deleción de 48 pares de bases (que involucran a 16 aa) en la región media con respecto a la cepas de referencia Tx30a y 87-203.

Los resultados anteriores nos sugieren una distribución de genotipos por región geográfica y por raza étnica. Una posible explicación sobre esta distribución de genotipos de vacA en poblaciones y áreas geográficas diferentes sería que estos resultados están relacionados con infección con una cepa ancestral que ha afectado a poblaciones con antecedentes históricos, genéticos, socioeconómicos y culturales comunes. Una hipótesis alterna sería que a través del tiempo las cepas de un solo genotipo hayan originado genotipos diversos, como el resultado de adaptaciones a un huésped con características y medio ambiente particulares. Cualquiera que sea la hipótesis, todos estos resultados apoyan que H. pylori presenta una gran variabilidad genética no sólo a nivel genomico sino también de genes particulares.

La citotoxina VacA que es codificada por el gen vacA se sintetiza como una protoxina de 140 kDa, la cual contiene tres dominios funcionales: una secuencia señal N-terminal de 33 aminoácidos (péptido líder de 3 kDa); la citotoxina madura de 87 kDa y; un dominio C-terminal de 50 kDa asociado a la membrana externa (Fig. 14) (22, 52, 60, 76, 78, 93). Para ser excretada la protoxina presenta ruptura tanto en su porción amino terminal (péptido señal) como en su región carboxilo terminal quedando un monómero de aproximadamente 95 kDa para formar una toxina madura constituida por 6 ó 7 monómeros que, al unirse, forman un arreglo estructural que semeja una flor de 6 ó 7 pétalos (Fig. 15) con un centro (anillo) de 30 nm de diámetro (14, 25, 29, 50, 52, 98). Cada monómero presenta una asa expuesta flexible, propensa a una ruptura proteolítica que la divide en dos subunidades: una de 37 kDa y otra de 58 kDa (14, 25, 29, 52, 55, 60, 78). Se desconoce, sin embargo, si esta ruptura es producida por la misma toxina o si existen proteasas externas asociadas con la superficie bacteriana responsables de la hidrólisis. También se desconoce si es necesario el procesamiento de las dos subunidades para la actividad tóxica. Cuando se expone VacA a pH ácido o a bases débiles como cloruro de amonio, se ha observado que ocurre una separación de los monómeros, acompañada por un aumento en la actividad vacuolizante en monocapas de células HeLa (10, 15, 22, 25, 29, 60). Estudios recientes han mostrado que la subunidad B de la citotoxina VacA es la responsable del reconocimiento del receptor en la superficie de células epiteliales, aunque se necesita de la interacción de ambas subunidades para que la toxina se interne y actúe. Estudios in vitro (57, 60) han demostrado que VacA se une a la célula por la interacción con receptores específicos y que esta unión depende de la concentración de la citotoxina, así como de la saturación de los receptores en la superficie celular. La citotoxina se interna al citosol, al parecer por una cinética comparable con una endocitosis mediada por receptor. Se ha propuesto que el receptor del factor de desarrollo del epidermis (EGF) y que una proteína de 140 kDa son los receptores para VacA (79, 96).

Se han reportado tres mecanismos de acción de la citotoxina vacuolizante. En el primero, la formación de grandes vacuolas en el citoplasma de las células epiteliales (Fig. 16), que se originan a nivel perinuclear hasta llenar completamente el citosol de la célula y causar su muerte (10, 15, 22, 26, 29, 44, 51, 68, 69). El lumen de las grandes vacuolas inducidas por VacA, tanto en el citoplasma de células de cultivo, como en el de células epiteliales gástricas, se acidifica por la actividad de una bomba de protones gracias a una ATP-asa de tipo vacuolar unida a la membrana de estas vesículas (26, 68, 69). La citotoxina VacA es capaz de alterar el tráfico de membranas a nivel endosoma-prelisosoma de manera tal que el tráfico de proteínas, de ligandos y el procesamiento de antígenos dependientes de ligandos se vean alterados y de causar un deterioro en la degradación proteolítica dentro de los lisosomas, ocasionando una disfunción letal para la célula. Otro mecanismo de acción independiente de la formación de vacuolas de VacA es el aumento en la permeabilidad de células al paso de moléculas de bajo peso molecular (72, 76, 82, 85), un fenómeno que, al parecer, aumenta el flujo de nutrimentos del interior de la célula hacia la submucosa favoreciendo la sobrevida de H. pylori. La adherencia de VacA a las células de las monocapas da como resultado la disminución de la resistencia trans-epitelial a través de las células. El tercer mecanismo de acción de la citotoxina es la formación de canales a través de la capa de lípidos de la membrana celular. El aumento en la conductividad de iones en las membranas endosomales ocasiona cambios osmóticos que aumentan la entrada de agua y, por consiguiente, un hinchamiento del compartimiento endosomal (72, 76, 82, 85, 98).

H. pylori cuenta con factores de virulencia claros y bien determinados involucrados en la patogénia de la enfermedad. La asociación del microorganismo con las diferentes patologías gástricas esta en la actualidad sin dudas. Sin embargo, la historia de la infección por H. pylori sugiere ser diferente en países desarrollados, con respecto a los países en vías de desarrollo, ya que está documentado que los factores de riesgo como el nivel socio-económico, las prácticas de higiene, el hacinamiento, el tabaquismo, el consumo alto de sal en la dieta, el consumo de alcohol entre otros, así como también, factores del huésped como la predisposición genética, el tipo de complejo mayor de histocompatibilidad y el tipo de antígeno Lewis etc., influyen en la infección y determinan el desarrollo de la enfermedad.

La frecuencia de reportes de infección múltiple cada vez es mayor, por lo que se debe de tomar en cuenta la coexistencia de cepas con genotipo diferente en los pacientes, analizando cual es el resultado de estas interacciones entre poblaciones. Es de notar que cepas de H. pylori de genotipos diferentes en una misma población parecen no competir entre ellas, permitiendo la libre sobrevivencia de varias cepas con genotipos diferentes. Ademas algunas cepas con determinados genotipos pueden tener ventajas sobre otras, favoreciendo el predominio de un tipo de cepa en la población o en un nicho ecológico determinado. Se puede suponer que la interacción de cepas de genotipos diferentes en una población favorezca un sinergismo entre ellas, determinando el desarrollo de la enfermedad. Existe la posibilidad de que se presente una reinfección continua con cepas de genotipo diferente a lo largo de la vida.

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